तंत्रिका नेटवर्क-आधारित विकास के सक्षम या अक्षम माउस की पहचान पूरी तरह से बड़े हो अंडाणुओं
Summary
यहाँ, हम कीटाणु पुटिका से metaphase द्वितीय चरण के लिए अपने में इन विट्रो परिपक्वता के दौरान प्रदर्शन किया oocyte विकासात्मक क्षमता के गैर इनवेसिव मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. इस विधि समय-चूक इमेजिंग कण छवि velocimetry (PIV) और तंत्रिका नेटवर्क विश्लेषण के साथ जोड़ती है ।
Abstract
बांझपन क्लीनिक गैर इनवेसिव प्रक्रियाओं का उपयोग कर, इस प्रकार समग्र गर्भावस्था के परिणाम में सुधार करने के लिए अक्षम अंडाणुओं के विकास के लिए सक्षम बनाम चयन करने की क्षमता से लाभ होगा । हम हाल ही में एक वर्गीकरण माउस अंडाणुओं के सूक्ष्म रहते टिप्पणियों के आधार पर विधि विकसित अपने इन विट्रो परिपक्वता के दौरान कीटाणु पुटिका (जी. वी.) से metaphase द्वितीय चरण के लिए, cytoplasmic आंदोलनों के विश्लेषण के बाद इस समय चूक अवधि के दौरान होने वाली । यहां, हम इस प्रक्रिया के विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । अंडाणुओं पूरी तरह से अलग कर रहे है कोटरीय रोम और एक समय के लिए सुसज्जित माइक्रोस्कोप के अंदर 15 घंटे के लिए-चूक विश्लेषण में ३७ ° c और 5% CO2। चित्र 8 मिनट के अंतराल पर लिया जाता है । छवियों कण छवि Velocimetry (PIV) विधि है कि गणना करता है का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं, प्रत्येक oocyte के लिए, Cytoplasmic आंदोलन वेग (CMVs) के प्रोफ़ाइल संस्कृति अवधि के दौरान होने वाली । अंत में, प्रत्येक एकल oocyte के CMVs एक गणितीय वर्गीकरण उपकरण के माध्यम से खिलाया जाता है (फ़ीड-आगे कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क, फैंन), जो एक gamete की संभावना की भविष्यवाणी के लिए विकास सक्षम या ९१.०३% की एक सटीकता के साथ अक्षम है । इस प्रोटोकॉल, माउस के लिए स्थापित है, अब मानव सहित अंय प्रजातियों के अंडाणुओं पर परीक्षण किया जा सकता है ।
Introduction
महिला बांझपन एक विकृति है कि महिलाओं की बढ़ती संख्या को प्रभावित करता है । विश्व स्वास्थ्य संगठन के अनुसार, जोड़ों के लगभग 20% ऊसर हैं, एक ४० महिला बांझपन के कारण% के साथ । इसके अलावा, एक तिहाई महिलाओं के कैंसर के उपचार के दौर से गुजर (300000/वर्ष और 30000/वर्ष संयुक्त राज्य अमेरिका या इटली में, क्रमशः) समयपूर्व डिम्बग्रंथि विफलता का विकास ।
एक रणनीति कैंसर रोगियों में बांझपन को रोकने के लिए अलगाव और आंकलोजिकल उपचार से पहले डिम्बग्रंथि कूप के cryopreservation है, इसके बाद इन विट्रो परिपक्वता (IVM) जीवी अंडाणुओं के लिए मिि चरण (जीवी-to-मिि संक्रमण) । oocyte विकासात्मक क्षमता के गैर इनवेसिव मार्कर की उपलब्धता निषेचन और विकासात्मक प्रक्रियाओं और समग्र गर्भावस्था सफलता1,2में सुधार होगा ।
उनके क्रोमेटिन विंयास के आधार पर supravital fluorochrome Hoechst ३३३४२ के साथ धुंधला के बाद मनाया, स्तनधारी पूरी तरह से उगाया अंडाणुओं या तो एक घेर Nucleolus (SN) या एक नहीं घिरा Nucleolus (NSN)3के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं । उनके अलग क्रोमेटिन संगठन के अलावा, इन दो प्रकार के अंडाणुओं प्रदर्शित कई रूपात्मक और कार्यात्मक मतभेद3,4,5,6,7,8 ,9, उनके meiotic और विकासात्मक क्षमता सहित । जब अंडाशय से अलग और इन विट्रो मेंपरिपक्व, अंडाणुओं के दोनों प्रकार के मिि चरण तक पहुंचने, और शुक्राणु गर्भाधान के बाद, 2-सेल चरण के लिए विकसित है, लेकिन केवल एक SN क्रोमेटिन संगठन के साथ उन के लिए विकसित कर सकते है अवधि 9। हालांकि सक्षम बनाम अक्षम अंडाणुओं के चयन के लिए एक वर्गीकरण विधि के रूप में अच्छा है, मुख्य दोष mutagenic प्रभाव है कि fluorochrome ही है और, सब से ऊपर, इसकी पहचान के लिए इस्तेमाल किया यूवी प्रकाश कोशिकाओं पर हो सकता है ।
इन सभी कारणों के लिए, हम एक ही उच्च वर्गीकरण सटीकता को बनाए रखते हुए Hoechst का उपयोग स्थानापन्न सकता है कि SN या NSN क्रोमेटिन अनुरूपता के साथ जुड़े अन्य गैर इनवेसिव मार्करों के लिए खोज की. Cytoplasmic मूवमेंट वेग (CMVs) का समय-चूक अवलोकन कोशिका स्थिति की एक विशेषता ौली के रूप में उभर रहा है. उदाहरण के लिए, हाल के अध्ययनों से निषेचन के समय में दर्ज CMVs के बीच सहयोग और माउस और मानव zygotes की क्षमता को पूरा करने के लिए पूर्ण और पूर्ण अवधि के विकास10,11प्रदर्शन किया ।
इन अध्ययनों के पहले के आधार पर, हम यहां का वर्णन विकास के लिए सक्षम या अक्षम माउस की मांयता के लिए एक मंच पूरी तरह से विकसित अंडाणुओं5,6,7,8। मंच तीन मुख्य चरणों पर आधारित है: 1) कोटरीय रोम से पृथक अंडाणुओं पहले अपने क्रोमेटिन विंयास के आधार पर या तो एक घेर nucleolus (SN) या एक नहीं घिरा nucleolus (NSN) के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं; 2) CMVs के समय-चूक छवियों जीवी-करने के लिए प्रत्येक एकल oocyte के मिि संक्रमण लिया और कण छवि velocimetry (PIV) के साथ विश्लेषण कर रहे हैं; और 3) PIV के साथ प्राप्त डेटा एक फ़ीड के साथ विश्लेषण कर रहे है आगे कृत्रिम तंत्रिका नेटवर्क (फैंन) ब्लाइंड वर्गीकरण के लिए12,13। हम माउस के लिए तैयार की प्रक्रिया के सबसे महत्वपूर्ण कदम का ब्यौरा देने के लिए यह परीक्षण करने के लिए उपलब्ध है और अंय स्तनधारी प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया (जैसे, गोजातीय, बंदर और मनुष्य) ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वहां कई महत्वपूर्ण कदम एक का ध्यान रखना चाहिए, जबकि माउस अंडाणुओं के साथ इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंय प्रजातियों के लोगों के साथ कर रहे हैं । एक बार उनके रोम से अलग, अंडाणु?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम संभव धन्यवाद द्वारा समर्थन करने के लिए बनाया गया था: पविया FRG २०१६ के विश्वविद्यालय; परमा FIL २०१४, २०१६ के विश्वविद्यालय; और इस अध्ययन को पूरा करने के लिए आवश्यक plasticware की आपूर्ति के लिए Kinesis । हम Dr. शेन विंडसर (इंजीनियरिंग के संकाय, ब्रिस्टल विश्वविद्यालय, यूके) Cell_PIV सॉफ्टवेयर प्रदान करने के लिए धंयवाद ।
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
Referências
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