Un'identificazione basato su rete neurale di ovociti adulto Mouse inerente allo sviluppo competente o incompetente
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione non invasiva della competenza di sviluppo dell’oocita eseguita durante la loro maturazione in vitro dalla vescicola germinale per la fase di metafase II. Questo metodo combina immagini time-lapse con particle image velocimetry (PIV) e analisi di rete neurale.
Abstract
Cliniche per l’infertilità trarrebbe vantaggio dalla possibilità di selezionare inerente allo sviluppo competente vs incompetente ovociti utilizzando procedure non invasive, migliorando così il risultato complessivo di gravidanza. Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di classificazione basato sull’osservazione diretta al microscopio oocytes del mouse durante la loro maturazione in vitro dalla vescicola germinale (GV) per la fase di metafase II, seguita dall’analisi dei movimenti citoplasmatici che si verificano durante questo periodo di time-lapse. Qui, presentiamo protocolli dettagliati di questa procedura. Gli ovociti sono isolati da follicoli antrali adulte e coltivati per 15 h all’interno di un microscopio equipaggiato per l’analisi time-lapse a 37 ° C e 5% CO2. Immagini sono prese ad intervalli di 8 min. Le immagini vengono analizzati utilizzando il metodo di Particle Image Velocimetry (PIV) che calcola, per ogni prelievo di ovociti, il profilo delle velocità di movimento citoplasmatica (CMVs) che si verificano durante tutto il periodo di cultura. Infine, il CMVs di ogni singolo ovocita sono alimentati attraverso uno strumento di classificazione matematica (rete neurale Feed-forward, FANN), che predice la probabilità di un gamete essere inerente allo sviluppo competente o incompetente con una precisione di 91.03%. Questo protocollo, impostare per il mouse, potrebbe ora essere testato su ovociti di altre specie, compreso gli esseri umani.
Introduction
Infertilità femminile è una patologia che colpisce un numero crescente di donne. Secondo l’organizzazione mondiale della sanità, circa il 20% delle coppie sono infertili, con un 40% a causa di infertilità femminile. In aggiunta, un terzo delle donne che subiscono trattamenti contro il cancro (300.000/anno e 30.000/anno negli USA o in Italia, rispettivamente) sviluppare insufficienza ovarica prematura.
Una strategia per prevenire l’infertilità in malati di cancro è l’isolamento e la crioconservazione dei follicoli ovarici prima del trattamento oncologico, seguita da maturazione in vitro (IVM) di ovociti GV alla fase MII (transizione GV-a-MII). La disponibilità di marcatori non invasivi di competenza di sviluppo dell’ovocita migliorerebbe la fertilizzazione e processi di sviluppo e il generale gravidanza successo1,2.
Basato sulla loro configurazione cromatinica osservato dopo colorazione con fluorocromo supravital Hoechst 33342, mammiferi adulti ovociti sono classificati come un nucleolo circondato (SN) o un nucleolo non circondato (NSN)3. Oltre a loro nell’organizzazione cromatinica diversi, questi due tipi di ovociti visualizzano molte differenze morfologiche e funzionali3,4,5,6,7,8 ,9, tra cui la loro competenza meiotica e inerente allo sviluppo. Quando isolato dall’ovaia e maturato in vitro, entrambi tipo di ovociti raggiungono la fase MII e dopo l’inseminazione di spermatozoi, sviluppare alla fase 2 celle, ma solo quelli con un’organizzazione della cromatina SN può sviluppare a termine9. Anche se buono come un metodo di classificazione per la selezione competente vs incompetente ovociti, lo svantaggio principale è l’effetto mutageno che il fluorocromo stesso e, soprattutto, la luce UV utilizzato per la sua individuazione potrebbe avere sulle cellule.
Per tutte queste ragioni, abbiamo cercato altri marcatori non invasivi associati con la conformazione cromatinica SN o NSN che potrebbe sostituire l’uso di Hoechst pur mantenendo la stessa accuratezza di classificazione alta. L’osservazione di time-lapse di citoplasmico velocità di movimento (CMVs) sta emergendo come una caratteristica distintiva dello stato della cella. Ad esempio, recenti studi hanno dimostrato che l’associazione fra CMVs registrato al momento della fecondazione e la capacità di mouse e zigoti umani di preimpianto completo e pieno-termine sviluppo10,11.
Basato su questi studi precedenti, descriviamo qui una piattaforma per il riconoscimento del mouse inerente allo sviluppo competente o incompetente ovociti adulto5,6,7,8. La piattaforma è basata su tre fasi principali: 1) ovociti isolati da follicoli antrali prima vengono classificati in base alla loro configurazione della cromatina sia come un nucleolo circondato (SN) o un nucleolo non-circondato (NSN); 2) time-lapse immagini di CMVs che si verificano durante la transizione di GV-a-MII di ogni singolo ovocita vengono presi ed analizzati con particle image velocimetry (PIV); e 3) i dati ottenuti con PIV sono analizzati con un Feed-forward artificiale Neural Network (FANN) per classificazione cieco12,13. Diamo dettagli delle fasi più critiche della procedura progettata per il mouse per renderlo pronto disponibile per essere testato e utilizzato per altre specie di mammiferi (ad es., bovino, scimmie e gli esseri umani).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi passaggi critici uno dovrebbe prendersi cura di durante l’esecuzione di questo protocollo con oocytes del mouse nonché con quelle di altre specie. Una volta isolato dai loro follicoli, ovociti dovrebbero essere immediatamente trasferiti nelle gocce di registrazione, come la separazione del cumulus compagno cellule trigger l’inizio della transizione GV-a-MII. Un’eventuale modifica del presente protocollo potrebbe essere l’aggiunta di 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) al M2 mezzo utilizzato per l’isolamen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato reso possibile grazie al sostegno di: Università di Pavia RFG 2016; Università di Parma FIL 2014, 2016; e Kinesis per fornire il plasticware necessarie per svolgere questo studio. Ringraziamo il Dr. Shane Windsor (facoltà di ingegneria, Università di Bristol, UK) per la fornitura del software di Cell_PIV.
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
Referências
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