En nevrale nettverk-basert identifikasjon av Developmentally kompetent eller inkompetent musen Fully-Grown Oocytes
Summary
Her presenterer vi en protokoll for ikke-invasiv vurdering av oocyte utviklingsmessige kompetanse utført under deres i vitro modning fra germinal vesicle på metaphase II scenen. Denne metoden kombinerer tidsinnstilt bildebehandling med partikkel bilde velocimetry (PIV) og nettverk analyser.
Abstract
Ufruktbarhet klinikker ville ha nytte av muligheten til å velge developmentally kompetent vs inkompetente oocytes bruker ikke-invasiv prosedyrer, dermed forbedre den generelle svangerskapsutfall. Vi har nylig utviklet en klassifisering metode basert på mikroskopisk live observasjoner av musen oocytes under deres i vitro modning fra germinal vesicle (GV) til metaphase II scenen, etterfulgt av analyse av cytoplasmatiske bevegelser forekommer i denne time-lapse perioden. Her presenterer vi detaljerte protokoller av denne prosedyren. Oocytes er isolert fra fully-grown Boas follicles og kultivert 15 h i mikroskop utstyrt for time-lapse analyse på 37 ° C og 5% CO2. Bildene er tatt på 8 min intervaller. Bildene analyseres ved hjelp av metoden partikkel bilde Velocimetry (PIV) som beregner, for hver oocyte, profilen til cytoplasmatiske bevegelsen fart (CMVs) oppstår i hele kultur perioden. Til slutt, CMVs av hver enkelt oocyte fôres gjennom en matematisk klassifisering verktøyet (Feed-forward kunstige nevrale nettverk, FANN), som anslår sannsynligheten for en Kjønnscelle developmentally kompetent eller inkompetente med en nøyaktighet på 91.03%. Denne protokollen, satt opp for musen, kan nå testes på oocytes av andre arter, inkludert mennesker.
Introduction
Kvinnelig ufruktbarhet er en patologi som påvirker et økende antall kvinner. Ifølge Verdens helseorganisasjon er rundt 20% av par ufruktbare, 40% på grunn av kvinnelig ufruktbarhet. I tillegg en tredjedel av kvinner som gjennomgår kreft behandlinger (300.000/år og 30.000 i året i USA eller Italia, henholdsvis) utvikle prematur eggstokksvikt.
En strategi for å hindre ufruktbarhet i kreftpasienter er isolasjon og kryonisk bevaring av eggstokkene follicles før oncological behandling, etterfulgt av i vitro modning (IVM) av GV oocytes til MII scenen (GV å MII overgang). Tilgjengeligheten av ikke-invasiv markører oocyte utviklingsmessige kompetanse ville forbedre befruktning og utviklingsprosesser og generelle graviditet suksess1,2.
Basert på deres chromatin konfigurasjon observert etter farging med den supravital fluorochrome Hoechst 33342, pattedyr fully-grown oocytes klassifiseres enten som en omgitt kjerne (SN) eller en ikke omgitt kjerne (NSN)3. Foruten deres ulike chromatin organisasjon vise disse to typer oocytes mange morfologiske og funksjonelle forskjeller3,4,5,6,7,8 ,9, inkludert deres meiotic og utviklingsmessige kompetanse. Når isolert fra eggstokken og modnet i vitro, både type oocytes rekkevidde MII scenen, og etter sperm inseminasjon, utvikle til 2-celle scenen, men bare de med en SN chromatin organisasjon kan utvikle til begrepet9. Selv om det er bra som en klassifisering metode for valg av kompetente vs inkompetente oocytes, er den største ulempen mutagene effekten som fluorochrome seg og, fremfor alt, UV-lyset brukes for oppdagelsen kan ha på cellene.
For alle disse grunner søkte vi på andre ikke-invasiv markører forbundet med SN eller NSN chromatin konformasjon som kan erstatte bruken av Hoechst samtidig opprettholde samme høye klassifisering nøyaktighet. Time-lapse observasjon av cytoplasmatiske bevegelsen fart (CMVs) fremstår som en funksjon karakteristiske celle status. For eksempel vist studier tilknytningen mellom CMVs registrert på tidspunktet for befruktning og kapasiteten til mus og menneskelig zygotes å fullstendig preimplantation og full sikt utvikling10,11.
Basert på disse tidligere studier, beskriver vi her en plattform for anerkjennelse av developmentally kompetent eller inkompetent musen fully-grown oocytes5,6,7,8. Plattformen er basert på tre hovedtrinn: 1) Oocytes isolert fra Boas follikler klassifiseres først basert på deres chromatin konfigurasjon enten som en omgitt kjerne (SN) eller en ikke-omgitt kjerne (NSN); 2) time-Lapse bilder av CMVs forekommer under GV å MII overgangen til hver enkelt oocyte tatt og analysert med partikkel bilde velocimetry (PIV); og 3) innhentet med PIV analyseres med en Feed-forward kunstige nevrale nettverk (FANN) for blinde klassifisering12,13. Vi gir detaljer om de viktigste trinnene i fremgangsmåten designet for musen for å gjøre den klar tilgjengelig testet og brukes for andre pattedyrarter (f.eks storfe, ape og mennesker).
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere viktige skritt man bør ta vare på mens de utfører denne protokollen med musen oocytes og de andre arter. Isolerte fra deres hårsekker oocytes bør umiddelbart overføres til opptak dråper, som separasjon fra følgesvenn cumulus celler utløsere begynnelsen av GV å MII overgangen. En mulig endring til stede protokollen kan være tillegg av 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) til M2 mediet som brukes for COCs isolasjon. IBMX forhindrer umiddelbar følge av GV å MII overgangen og tillater en synkroniserin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble gjort mulig takket være støtte av: Universitetet i Pavia FRG 2016; Universitetet i Parma FIL 2014, 2016; og Kinesis for å forsyne plasticware nødvendig å gjennomføre denne studien. Vi takker Dr. Shane Windsor (avdeling for ingeniørutdanning, University of Bristol, UK) for å gi Cell_PIV programvaren.
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
Referências
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?. Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
