Een neuraal netwerk-gebaseerde identificatie van ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente muis volgroeide eicellen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor niet-invasieve beoordeling van ontwikkelingsstoornissen bekwaamheid oöcyt uitgevoerd tijdens hun rijping in vitro van het vesikel germinal aan de metafase-II. Deze methode combineert time-lapse imaging met particle image velocimetry (PIV) en neurale netwerk analyses.
Abstract
Onvruchtbaarheid klinieken zou profiteren van de mogelijkheid om te kiezen van ontwikkelingsachterstand bevoegde vs. incompetent eicellen met behulp van niet-invasieve procedures, dus de verbetering van de algehele uitkomst van de zwangerschap. We onlangs ontwikkelde een methode van de classificatie gebaseerd op microscopische levende observaties van muis eicellen tijdens hun rijping in vitro van de germinal Vesikel (GV) naar de metafase-II fase, gevolgd door de analyse van de cytoplasmatische bewegingen Deze time-lapse periode optreedt. Hier presenteren we gedetailleerde protocollen van deze procedure. Eicellen zijn geïsoleerd van volgroeide follikelgroei follikels en gekweekte voor 15u binnen een microscoop voorzien voor time-lapse analyse bij 37 ° C en 5% CO2. Foto’s zijn genomen op 8 min intervallen. De beelden worden geanalyseerd met behulp van de Particle Image Velocimetry (PIV) methode die berekent, voor elke oöcyt, het profiel van cytoplasmatische beweging snelheden (CMVs) die zich voordoen gedurende de cultuur. Tot slot, de CMVs van elke één oöcyt worden gevoed via een wiskundige indeling-hulpprogramma (Feed-forward kunstmatig neuraal netwerk, FANN), die de kans op een gameet ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente met een nauwkeurigheid van 91.03% voorspelt. Dit protocol, ingesteld voor de muis, kon nu worden getest op de eicellen van andere soorten, inclusief de mens.
Introduction
Vrouwelijke onvruchtbaarheid is een pathologie die een steeds groter aantal vrouwen treft. Volgens de World Health Organization zijn ongeveer 20% van de paren onvruchtbaar, met een 40% als gevolg van vrouwelijke onvruchtbaarheid. Bovendien is eenderde van de vrouwen kankerbehandelingen ondergaan (300.000/jaar en 30.000/jaar in de VS of Italië, respectievelijk) ontwikkelen van prematuur ovarieel falen.
Een strategie ter voorkoming van onvruchtbaarheid bij kankerpatiënten is het isolement en de cryopreservatie van ovariële follikels voordat de oncologische behandeling, gevolgd door in vitro maturatie (GODT) van GV eicellen naar de MII fase (GV-naar-MII overgang). De beschikbaarheid van niet-invasieve merkers van oöcyt developmental bevoegdheid zou verbeteren de bevruchting en de ontwikkelings processen en de algehele zwangerschap succes1,2.
Op basis van de configuratie van de chromatine waargenomen na kleuring met de supravital fluorescerende Hoechst 33342, zoogdieren volgroeide eicellen worden geclassificeerd als een omgeven Nucleolus (SN) of een niet omgeven Nucleolus (NSN)3. Naast de organisatie van hun verschillende chromatine weer deze twee soorten eicellen vele morfologische en functionele verschillen3,4,5,6,7,8 ,9, met inbegrip van hun bevoegdheid Meiotische en ontwikkelingsproblemen. Als geïsoleerd van het ovarium en verviel in vitro, beide typen van oöcyten reach de MII-fase, en na inseminatie behandeld zijn sperma ontwikkelen naar de fase 2-cel, maar alleen degenen met een SN chromatine organisatie kunnen ontwikkelen tot en met9van de termijn. Hoewel goed als een indelingsmethode voor het selecteren van bevoegde vs. incompetent eicellen, is het belangrijkste nadeel de mutagene werking die de fluorescerende zelf en, vooral, het UV-licht wordt gebruikt voor de detectie zou kunnen op de cellen hebben.
Om al deze redenen, we hebben gezocht naar andere niet-invasieve merkers die is gekoppeld aan de SN of NSN chromatine conformatie die het gebruik van Hoechst met behoud van dezelfde hoge classificatie nauwkeurigheid kan vervangen. De time-lapse waarneming van cytoplasmatische beweging snelheden (CMVs) is in opkomst als een functie kenmerkend voor de status van de cel. Bijvoorbeeld, recente studies aangetoond dat de associatie tussen CMVs opgenomen op het moment van bevruchting en de capaciteit van muis en mens zygoten volledige pre-implantatie te voldragen ontwikkeling10,11.
Op basis van deze eerdere studies, beschrijven we hier een platform voor de erkenning van ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente muis volgroeide eicellen5,6,7,8. Het platform is gebaseerd op drie hoofdstappen: 1) eicellen geïsoleerd uit follikelgroei follikels zijn eerst ingedeeld op basis van hun chromatine configuratie ofwel als een omgeven nucleolus (SN) of een niet-omringd nucleolus (NSN); 2) time-Lapse beelden van CMVs die zich voordoen tijdens de overgang van de GV-naar-MII van elke één oöcyt worden genomen en geanalyseerd met particle image velocimetry (PIV); en 3) de gegevens die zijn verkregen met PIV worden geanalyseerd met een Feed-forward kunstmatige neurale netwerk (FANN) voor blind classificatie12,13. Wij geven details van de belangrijkste stappen van de procedure die is ontworpen voor de muis om het beschikbaar worden getest en worden gebruikt voor andere soorten zoogdieren (bijvoorbeeld runderen, aap en mens) klaar te maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende kritische stappen een zorgen moet voor tijdens het uitvoeren van dit protocol met muis eicellen alsook met die van andere soorten. Het geïsoleerde uit hun follikels eicellen overgedragen moeten worden onmiddellijk in de opname druppels, zoals de scheiding van de metgezel-cumulus triggers cellen het begin van de overgang van de GV-naar-MII. Een mogelijke wijziging van het huidige protocol zou de toevoeging van 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) naar de M2 medium gebruikt voor isolatie van de COCs. I…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mogelijk gemaakt dankzij steun van: Universiteit van Pavia FRG 2016; Universiteit van Parma FIL 2014 2016; en Kinesis voor het verstrekken van de plasticware nodig om deze studie te verrichten. Wij danken Dr. Shane Windsor (Faculteit Ingenieurswetenschappen, Universiteit van Bristol, UK) voor het verstrekken van de Cell_PIV software.
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
Referências
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?. Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
