Una identificación basada en redes neuronal desarrollo competentes o incompetentes adulto de ovocitos de ratón
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la evaluación no invasiva de competencia desarrollo de oocito durante su maduración en vitro de la vesícula germinal a la etapa de metafase II. Este método combina la proyección de imagen de Time-lapse con partículas imagen velocimetry (PIV) y análisis de redes neuronales.
Abstract
Clínicas de infertilidad se beneficiarían de la capacidad para seleccionar al desarrollo competente vs incompetente ovocitos utilizando procedimientos no invasivos, mejorando así el resultado general del embarazo. Recientemente se desarrolló un método de clasificación basado en observaciones energizados microscopio de ovocitos de ratón durante su maduración en vitro de la vesícula germinal (VG) a la etapa de metafase II, seguida por el análisis de los movimientos citoplasmáticos que ocurre durante este período de lapso de tiempo. Aquí, presentamos protocolos detallados de este procedimiento. Ovocitos son aislados folículos antrales adulto y cultivados durante 15 h dentro de un microscopio equipado para Time-lapse análisis a 37 ° C y 5% CO2. Los cuadros son tomados a intervalos de 8 minutos. Las imágenes son analizadas utilizando el método de imagen de partícula Velocimetry (PIV) que calcula, para cada ovocito, el perfil de velocidades de movimiento citoplásmico (CMVs) que ocurren durante el período de la cultura. Por último, CMVs de cada ovocito solo son alimentados a través de una herramienta de clasificación matemática (red neuronal Artificial de Feed-forward, FANN), que predice la probabilidad de que un gameto al desarrollo competente o incompetente con una precisión de 91.03%. Este protocolo, configurar el ratón, ahora podría ser probado en ovocitos de otras especies, incluyendo a seres humanos.
Introduction
Infertilidad femenina es una patología que afecta a un número creciente de mujeres. Según la Organización Mundial de la salud, 20% de las parejas son infértil, con un 40% debido a la infertilidad femenina. Además, un tercio de las mujeres sometidas a tratamientos contra el cáncer (300.000/año y 30.000 al año en Estados Unidos o Italia, respectivamente) desarrollar falla ovárica prematura.
Una estrategia para prevenir la infertilidad en pacientes con cáncer es el aislamiento y criopreservación de los folículos ováricos antes del tratamiento oncológico, seguido de maduración en vitro (MIV) de ovocitos GV a la etapa MII (transición de GV a MII). La disponibilidad de marcadores no invasivos de competencia desarrollo de ovocitos mejoraría a la fertilización y procesos de desarrollo y el éxito embarazo general1,2.
En función de su configuración de cromatina observada después de la tinción con el fluorocromo supravital Hoechst 33342, mamíferos adulto ovocitos se clasifican ya sea como un nucleolo rodeado (SN) o un nucleolo no rodeado (NSN)3. Además de su organización de la cromatina diferentes, estos dos tipos de ovocitos Mostrar muchas diferencias morfológicas y funcionales3,4,5,6,7,8 ,9, incluyendo su competencia meiótica y de desarrollo. Cuando aislado el ovario y madurado en vitro, tipo de ovocitos alcance la etapa MII y después de la inseminación de esperma, desarrollar a la fase de 2 células, pero sólo aquellos con una organización de la cromatina de SN pueden desarrollar a plazo9. Aunque bueno como un método de clasificación de selección competente vs incompetente ovocitos, el principal inconveniente es el efecto mutagénico que el fluorocromo sí mismo y, sobre todo, la luz UV utilizada para su detección podrían tener en las células.
Por todas estas razones, hemos buscado otros marcadores no invasivos asociados a la conformación de la cromatina SN o NSN que podría sustituir el uso de Hoechst manteniendo la misma precisión de clasificación alta. La observación de Time-lapse de las velocidades de movimiento citoplásmico (CMVs) está emergiendo como una característica distintiva del estado de la célula. Por ejemplo, estudios recientes demostraron que la asociación entre CMVs grabado en el momento de la fecundación y la capacidad del ratón y cigotos humanos preimplantacional completo y termino desarrollo10,11.
Basado en estos estudios anteriores, Describimos aquí una plataforma para el reconocimiento de desarrollo competente o incompetente ratón adulto ovocitos5,6,7,8. La plataforma se basa en tres pasos principales: 1) ovocitos de folículos antrales en primer lugar se clasifican en función de su configuración de cromatina ya sea como un nucleolo rodeado (SN) o un nucleolo rodeado no (NSN); 2) imágenes Time-lapse de CMVs que ocurren durante la transición de la GV a MII de cada ovocito solo se toman y analizan con partículas imagen velocimetry (PIV); y 3) se analizaron los datos obtenidos con PIV con un Feed-forward Artificial Neural Network (FANN) clasificación ciega12,13. Nos dan detalles de los pasos más críticos del procedimiento diseñado para que el ratón que esté listo para ser probado y utilizado por otras especies de mamíferos (p. ej., bovinos, monos y seres humanos).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos críticos uno debe cuidar al realizar este protocolo con ovocitos de ratón, así como con los de otras especies. Una vez aisladas de sus folículos, ovocitos deben ser transferidos inmediatamente en las gotas de la grabación, como la separación de la cumulus compañero células activa el inicio de la transición de la GV para MII. Una posible modificación en el presente Protocolo podría ser la adición de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) M2 medio utilizado para el aislamiento de los AOC. IBMX evita …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue hecho posible gracias al apoyo de: Universidad de Pavia RFA 2016; Universidad de Parma FIL 2014, 2016; y Kinesis para el suministro de los recipientes de plástico necesario para llevar a cabo este estudio. Agradecemos al Dr. Shane Windsor (Facultad de ingeniería, Universidad de Bristol, Reino Unido) para proporcionar el software de Cell_PIV.
Materials
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
Referências
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