신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지
Summary
꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 세포내 수송을 공부 하는 좋은 모델입니다. 여기, 내가 vivo에서 녹음 및 C. 선 충에 axonal intraflagellar 수송의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
Axonal 전송 및 intraflagellar 전송 (IFT) 축 삭과 속눈썹 morphogenesis 및 기능에 대 한 필수적입니다. Kinesin superfamily 단백질과 다 분자 모터를 각각 참가자 및 역행 전송 규제 있습니다. 이 모터는 레일으로 microtubule 네트워크를 사용합니다. 꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 전송 및 IFT에서 vivo에서공부 하는 강력한 모델 생물 이다. 나 axonal 교통과 IFT 생활에서 관찰 하는 프로토콜을 설명 하는 여기, C. 선 충. 수송된 화물 화물 단백질 같은 녹색 형광 단백질 (GFP) 형광 단백질을 사용 하 여 태그를 추가 하 여 구상 될 수 있다. C. 선 충 은 투명 하 고 GFP 태그 화물 단백질 세포 특정 발기인에서 특정 셀에 표현 될 수 있습니다. 살아있는 벌레 살인 또는 벌레를 마비 없이 10 %agarose 젤에 microbeads에 의해 해결할 수 있습니다. 이러한 조건 하에서 화물 움직임 관찰 될 수 있다 직접 축 삭 및 생활의 속눈썹에 절 개 없이 C. 선 충 . 이 메서드는 대상 단백질을 수정 하 여 셀 또는 셀에 표현에서 어떤 화물 분자의 관찰에 적용할 수 있습니다. 가장 기본적인 단백질 분자 모터 및 axonal 교통과 IFT에 관련 된 어댑터 단백질 C. 선 충에 보존 됩니다. 다른 모델 유기 체에 비해, 돌연변이 얻은 고 C. 선 충에 더 쉽게 유지. 이 메서드를 결합 하 여 다양 한 선 충 C. 돌연변이와 axonal 교통과 IFT의 분자 메커니즘 명확히 수 있습니다.
Introduction
라이브 셀 이미징 세포내 수송을 분석 하기 위한 필수적인 도구입니다. 신경 세포 생물학에서 라이브 셀 이미징 axonal 전송의 분석 신경 기능과 morphogenesis1를 이해 하기 위한 필수적입니다. 결함 axonal 전송에 여러 가지 신경 장애2기반이 됩니다. Kinesin superfamily 단백질과 다 수행 axonal 전송 anterogradely 그리고 retrogradely, 각각1,2.
속눈썹은 다른 세포질 격실 있는 microtubule 네트워크 및 밀매 기계는 고도로 발달된3. 단백질 종합 기계 하지 속눈썹 팁 속눈썹 단백질 세포질에서 수송 되어야 한다 즉, 속눈썹에 지역화 됩니다. 속눈썹 전용 kinesin 다, 라는 각각 kinesin-2와 세포질 다-2, 속눈썹4, intraflagellar 전송 (IFT)5라는 현상의 구성 요소를 전송. IFT의 장애 ciliopathies6라는 질병의 스펙트럼을 발생 합니다. 따라서, 라이브 셀 이미징에 의해 IFT 메커니즘의 분석 속눈썹 형성과 pathogenesis의 기본 메커니즘을 이해 해야 합니다.
꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 교통과 IFT7,,89공부 하기 좋은 모델입니다. 관찰 하기 위해 IFT, Chlamydomonas 은 모델 생물5,6으로 널리 사용 되었습니다. Chlamydomonas 는 단 세포 유기 체, 노화, 신경 기능과 동작 IFT의 관계 분석 하기 어려울 것 이다. 또한, CRISPR/Cas9 등 필수 유전자 기술 하지 Chlamydomonas에 적용 되었을. 높은 모델 생물, 초파리, 쥐 등 자주 axonal 교통과 IFT 중단 하면 치명적인 고기 axonal 교통과 IFT morphogenesis 및 동물 10의 항상성 위해 필수적 이기 때문에 11. 마우스의 경우 세포 배양과 transfection은 일반적으로 필요 axonal 교통과 IFT, 많은 기술 및 광범위 한 시간12,13필요를 관찰 합니다. 또한, 중요 한 생리 적 맥락을 많이 배양된 세포 및 셀 손실 수 있습니다. C. 선 충 돌연변이 axonal 전송 또는 IFT 혼란 된다 신 경계는 벌레의 생존에 필수적 이기 때문에 없습니다 종종 치명적인7,,914. Axonal 교통과 IFT 관찰할 수 있습니다 직접 vivo에서 절 개 없이 선 충 C. 투명 이며 따라서 GFP 태그 마커를 관찰 하기 쉽게 때문에.
C. 선 충, 마 취16, 또는 microbeads17미세 장치15, agarose 패드를 사용 하 여 고정을 여러 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 마 취의 포함 신경15밀매 이벤트를 억제 수 있습니다. 미세 장치 메서드는 분명 단점은 그 미세 장치를 준비 하 고 항상 쉽지 않다입니다. 대신, immobilization agarose 패드와 microbeads에 의해 C. 선 충에서 시간 경과 화상 진 찰을 수행 하는 편리 하 고 쉬운 방법 이다. 여기, 제가 설명 C. 선 충 을 무력화 하 고 시각화 axonal 전송 IFT에서 vivo에서 에서이 기본 프로토콜 C. 선 충. 다른 방법에 비해, 여기 설명 하는 방법을 특별 한 장비가 필요 하지 않습니다 하 고 훨씬 저렴 하 고 쉽게 수행 하는.
Protocol
Representative Results
Discussion
기존의 방법에 관하여 제한
여기 설명 하는 방법은 관찰 axonal 전송 등 IFT 빠른 이벤트 최적화 됩니다. 따라서, 동원 정지는 더 이상 부 화 보다 우선 됩니다. 우리는 중요 한 섭 동 없이 적어도 20 분 동안 매매 이벤트를 관찰할 수 있다,이 방법은 않을 수 있습니다 항상 축 삭 신장 등 셀 마이그레이션 더 이상 관찰을 요구 하는 느린 이벤트를 관찰 하는 적당 한. 더 이상 관찰에 대 한 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
깊이 저자 박사 아 사코 스 기 모토 (도호쿠 대학) 그녀의 도움이 토론 감사합니다. wyIs251 박사 강 쉔 (스탠포드 대학)에서 관대 한 선물 했다. mnIs17 는 NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금 CGC에 의해 제공 했다. 이 작품은 JSP KAKENHI 그랜트 #17 H 05010 및 #16 H 06536와 다이 이치 산 쿄 재단, 뇌 과학 재단과 나이토 재단에 의해 지원 되었다.
Materials
| Slideglass (76 x 26 mm) | Matsunami | S1111 | |
| Coverglass (22 x 40 mm) | Matsunami | C024401 | |
| Agarose | Wako | 318-01195 | |
| Polystylene microbeads 0.1 micron | Polysciences | #00876 | |
| Heat block | TAITEC | 0063288-000 | CTU-mini |
| Microscope | Olympus | IX-71 | widefield microscope |
| Spinning disk Scanner | Yokogawa | CSU-X1 | spinning disc confocal scanner |
| Digital CCD camera | Hamamatsu Photonics | C10600-10B | ORCA-R2 degital CCD camera |
| Objective lens (x100, NA1.4) | Olympus | UPLSAPO 100XO | |
| Pasteur pipette (5 inch) | IWAKI | IK-PAS-5P | |
| Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) | IWAKI | 9820TST15-105NP | |
| TV9211: wyIs251 | Laboratory of Kang Shen | N/A | |
| OTL11: mnIs17 | Ref. 27, 29 | N/A | SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times |
| Stereo microscope | Carl Zeiss | 435064-9000-000 | STEMI 508 |
| Mirror transillumination unit | Carl Zeiss | 435425-9010-000 | |
| platinum wire (0.2 mm) | Nilaco Corporation | m78483501 | |
| 60 mm plastic dish | Falcon | #351007 | |
| Fiji | N/A | N/A | https://fiji.sc/ |
| nematode growth medium (NGM) | 1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 |
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