JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Протокол для слежения в реальном времени 3D одной частицы

Published: January 03, 2018
doi:
10.3791/56711
,
1Department of Chemistry,Duke University

Summary

Этот протокол детали, строительства и эксплуатации микроскопом отслеживания в реальном времени 3D одной частицы, способных отслеживания наноразмерных флуоресцентных зондов на высоких скоростях диффузионные и низкой Фотон количество ставок.

Abstract

Реальном времени трехмерных одной частицы, отслеживание (RT-3D-SPT) имеет потенциал, чтобы пролить свет на быстрый, 3D процессы в клеточных системах. Хотя различные методы RT-3D-ДПМ были выдвинуты в последние годы, отслеживание высокой скорости 3D диффундирующих частиц при низкой Фотон количество ставок остается проблемой. Кроме того RT-3D-SPT установках, как правило, сложной и трудно осуществить, ограничивая их широкое применение в биологических проблем. Этот протокол представляет собой систему RT-3D-SPT, названный 3D динамических Фотон локализации слежения (3D-DyPLoT), который может отслеживать частиц с высоким диффузионными скорость (до 20 мкм2/s) скоростью всего низкой Фотон (до 10 кГц). 3D-DyPLoT использует 2D дефлектора Электро Оптика (2D-ПС) и перестраиваемый акустическая градиента (TAG) объектив ехать один сосредоточены лазерного пятно динамически в 3D. В сочетании с оптимизированной позиции алгоритм оценки, можно заблокировать 3D-DyPLoT на одной частицы с высокой скорость и точность высокая локализация. Благодаря одной возбуждения и одного обнаружения пути макет 3D-DyPLoT, надежные и легко установить. Этот протокол описывает, как построить 3D-DyPLoT шаг за шагом. Во-первых оптических макет описывается. Далее система калибруется и оптимизированные растровых сканирование 190 Нм флуоресцентные бисера с пьезоэлектрический nanopositioner. Наконец для демонстрации в реальном времени 3D отслеживания способности, 110 Нм флуоресцентные бусины отслеживаются в воде.

Introduction

Появление передовые методы обработки изображений открыл окно, чтобы увидеть более подробную структуру клеточных явлений, все, вплоть до молекулярном уровне. Методы, такие как стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм)1,2,3, Фото активированный локализации микроскопии (PALM)4,5,6,7 , структурированные освещения микроскопии (SIM)8,9,10,11и стимулировали выбросов истощения микроскопии (интереса)12,13, 14 далеко вышли за рамки дифракционный предел доставлять беспрецедентным деталь в структуру и функции живых клеток. Однако полное понимание, каким образом эти системы ведут себя требует динамическую информацию, а также структурную информацию. Перечисленные выше методы суперразрешением включают компромисс между пространственным разрешением и временное разрешение, ограничивая временная точность, с которой может быть исследован динамических процессов. Метод, который обеспечивает высокоточное пространственное и временное разрешение является RT-3D-SPT15,16,,1718,19,20, 21,,2223,24,25,26,27,,2829. Здесь, мы провести различие между традиционными 3D-SPT30 и RT-3D-мсете традиционное 3D-SPT просто требует временных рядов данных трехмерного изображения (которое может быть приобретено либо с помощью Конфокальный микроскоп или помощью эпифлуоресцентного микроскопа учитывая правильную конфигурацию). В традиционных 3D-SPT координаты частицы определяются после сбора данных путем нахождения частицы в каждом стека изображений и сцеплением места в последующих томах для создания траектории. Для этих методов конечная временное разрешение определяется уровень объемных изображений. Конфокальные микроскопы это легко на шкале секунд до десятков секунд. Для эпифлуоресцентного методов, в котором оптического пути управляется так, что можно извлечь сведения о расположении осевая, временное разрешение ограничено время экспозиции или индикация камеры. Эти методы epifluorescent ограничены в диапазоне, над которой осевой информация может собираться, хотя недавний прогресс в фазе плоскости Фурье маски дизайн и адаптивной оптики расширяет эти диапазоны 10 мкм или более31,32 , 33 , 34.

В отличие от RT-3D-ДПМ не полагаться на получения стека 3D изображений и частиц после факта. Вместо этого в реальном времени местоположение информация извлекается через одну точку детекторы и обратной связи применяется к эффективно «блокировка» частицы в фокуса тома объектива с помощью высокоскоростных пьезоэлектрический стадии. Это позволяет непрерывное измерение частиц позиции ограничены только, сколько фотонов может быть собрана. Кроме того этот метод позволяет спектральных допроса частицы, как она движется на больших расстояниях. RT-3D-ДПМ в силу работ сродни усили свободно оптические ловушки для наноразмерных объектов, которой частицы непрерывно исследован и измеряется в режиме реального времени без необходимости для больших лазерных держав или оптическим сил. Учитывая, что RT-3D-SPT предоставляет средства для непрерывного допроса быстро диффузионное объектов (до 20 мкм2/s) в трех измерениях на низкой Фотон фото цены20,29,25,29 35, он должен обеспечить окно в быстрый или переходные биологические процессы внутриклеточной грузовой транспорт, Связывание лиганда рецепторов и внеклеточного динамику одного вирионы. Однако к этой точке, применение RT-3D-SPT была ограничена горсть групп, работающих для продвижения этой технологии.

Один барьер является сложность оптических макет требует RT-3D-SPT методами, которые разнообразны. Для большинства методов оптической обратной связи обеспечивается пьезоэлектрический стадии. Как делает небольшие движения частицы в X, Y, или Z, индикацию от одной точки детекторы преобразуются в ошибки функции и кормили на высокоскоростной пьезоэлектрический nanopositioner, который в свою очередь, перемещает образец эффективно противодействовать движения частиц, Блокировка на месте относительно объектива. Для измерения малых позиционные движений в X, Y и Z, несколько детекторов (4 или 5 в зависимости от реализации)15,18,21 или несколько пятен возбуждения (2-4, ниже которого может применяться, если блокировки в усилитель используется для извлечения X и Y позиции с помощью вращающейся лазерного пятна)25,28 применяются. Дублирование этих несколько точек обнаружения и выбросов делают системы трудно согласовать и поддерживать.

Здесь мы представляем высокоскоростной 3D-SPT, к морю целевого метода с упрощенной оптического дизайна под названием 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT использует 2D-ПС и тег объектив36,,3738 для динамического перемещения пятно сфокусированного лазерного через объективные фокуса тома на высокой скорости (50 кГц XY, 70 кГц Z). Сочетая лазерный фокус позиции и время прибытия Фотон позволяет 3D позиция частицы необходимо быстро получить даже при низкой Фотон количество ставок. 2D-EOD диски лазерный фокус в Рыцарский тур шаблон39 квадратных размером 1 x 1 мкм в плоскости X-Y и тег объектив лазерный фокус перемещается в осевом направлении с кругом 2-4 мкм. Позиция 3D частицы получается с оптимизированной позиции оценки алгоритм29,40 в 3D. Контроль за 3D динамически движущихся лазерного пятна, фотон считая от лавинный фотодиод (APD), расчет позиции реального времени частицы, пьезоэлектрический стадии обратной связи и записи данных выполняются на массив поля программируемый Гейт (FPGA).В этом протоколе мы описывают как построить микроскопом 3D-DyPLoT, шаг за шагом, включая оптическое выравнивание, калибровка с фиксированной частиц и наконец свободной частицы отслеживания. В качестве демонстрации 110 Нм флуоресцентные бусины были отслежены непрерывно в воде минут за один раз.

Метод, описанный здесь является идеальным выбором для любого приложения, где желательно постоянно следить за быстро движущихся флуоресцентного зонда в низкой освещенности, включая вирусы, наночастиц и везикулы, например endosomes. В отличие от предыдущих методов есть только один возбуждения и одного обнаружения пути, делая простой выравнивание и техническое обслуживание. Кроме того большой обнаружения области позволяет этот Микроскоп легко забрать быстро диффундирующих частиц, в то время как способность отслеживать сигнал низкого уровня (до 10 кГц) делает этот метод идеально подходит для низкой освещенности приложений29.

Protocol

1. Установка расположение и выравнивание Установка и коллимации отслеживания возбуждения лазер Прикрепите лазер в оптических таблицу с использованием горе построен дом. Гора является простой алюминиевой пластине с монтажными отверстиями для лазерной головкой и таблицы о?…

Representative Results

Фиксированной частиц, сканирование (Рисунок 4) и свободно диффундирующих 110 Нм флуоресцентные частицы отслеживания (рис. 5) были проведены после выше протокол. Частица сканирования была выполнена путем перемещения пьезоэлектрический nano…

Discussion

Хотя в последние годы возникли много разновидностей 3D одной частицы, методы отслеживания, надежные слежение в реальном времени 3D высокая скорость диффузии ставкам всего низкой фотонов с простой установки по-прежнему вызов, который ограничивает его применение в отношении важных биоло?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержку путем национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под номером премии R35GM124868 и Университет Дьюка.

Materials

2D Electro-optic Deflector  ConOptics M310A 2 required
Power supply for EOD ConOptics 412 Converts FPGA ouput to high voltage for EOD
TAG  Lens TAG Optics TAG 2.0 Used to deflect laser along axial direction
XY piezoelectric nanopositioner MadCity Labs Nano-PDQ275HS Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in 
Z piezoelectric nanoposiitoner MadCity Labs Nano-OP65HS Used to move the objective lens to follow the diffusing particle
Micropositioner MadCity Labs MicroDrive Used to coarsely position sample and evaluate
Objective Lens Zeiss PlanApo High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss
sCMOS camera PCO pco.edge 4.2 Used to monitor the particle's position
APD Excelitas SPCM-ARQH-15 Lower dark counts beneficial
Field programmable gate array National Instruments NI-7852r
Software National Instruments LabVIEW
Tracking excitation laser JDSU FCD488-30
Lens ThorLabs AC254-150-A-ML L1
Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L2
Pinhole ThorLabs P75S PH
Glan-Thompson Polarizer ThorLabs GTH5-A GT
Half-wave plate ThorLabs WPH05M-488 WP
Lens ThorLabs AC254-75-A-ML L3
Lens ThorLabs AC254-250-A-ML L4
Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L5
Lens ThorLabs AC254-200-A-ML L6
Dichroic Mirror Chroma ZT405/488/561/640rpc DC
Fluorescence Emission Filter Chroma D535/40m F
10/90 beamsplitter Chroma 21012 BS
PBS Sigma D8537
190 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/9942
110 nm fluorescent nanoparticles Bangs laboratories FC02F/10617
Coverslip Fisher Scientific 12-545A
Powermeter Thorlabs PM100D
CMOS Thorlabs DCC1545M
Iris Thorlabs SM1D12D
Microscope Mad City Labs RM21
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  2. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  3. Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells. Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).
  4. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  5. Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
  6. Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  7. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).
  8. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).
  9. Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).
  10. Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198, 82-87 (2000).
  12. Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED). Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).
  13. Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).
  14. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  15. Welsher, K., Yang, H. Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles. Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).
  16. Welsher, K., Yang, H. Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy. Faraday Discuss. 184, 359-379 (2015).
  17. Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking. J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).
  18. Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles. Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).
  19. Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts. Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).
  20. Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions. ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).
  21. Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells. Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).
  22. Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. Three-dimensional tracking of individual quantum dots. Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).
  23. McHale, K., Mabuchi, H. Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope. Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).
  24. McHale, K., Mabuchi, H. Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm. J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).
  25. McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking. Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).
  26. Juette, M. F., Bewersdorf, J. Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution. Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).
  27. Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking. ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).
  28. Perillo, E. P., Liu, Y. -. L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -. K., Hung, M. -. C., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, (2015).
  29. Hou, S., Lang, X., Welsher, K. Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot. Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).
  30. Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).
  31. Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions. Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).
  32. Lee, H. -. l. D., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision. Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).
  33. Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).
  34. Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges. Optica. 4 (3), 367-373 (2017).
  35. Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606 (2017).
  36. Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing. Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).
  37. Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics. BIOMEDO. 17 (5), (2012).
  38. Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens. Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).
  39. Wang, Q., Moerner, W. E. Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap. Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).
  40. Fields, A. P., Cohen, A. E. Optimal tracking of a Brownian particle. Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).
  41. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).

Tags

3D Single Particle TrackingReal-time MicroscopyVirology488 Nm LaserElectro-optic DeflectorsTunable Acoustic Gradient LensAvalanche PhotodiodeFPGAFluorescent BeadsPhosphate Buffered SalineWaterNano PositionerPhoto DetectorFocal PlaneRaster Scan
check_url/pt/56711?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Hou, S., Welsher, K. A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking. J. Vis. Exp. (131), e56711, doi:10.3791/56711 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image