Tvådimensionell gelelektrofores tillsammans med masspektrometri metoder för en analys av mänskliga hypofysen adenom vävnad proteomet
Summary
Här presenterar vi en tvådimensionell gelelektrofores (2DE) i kombination med masspektrometri (MS) för att separera och identifiera mänskliga hypofysen adenom vävnad proteomet, som presenterar ett bra och reproducerbara 2DE mönster. Många proteiner kan observeras i varje 2DE plats när analysera komplexa cancer proteomet med användning av hög känslighet MS.
Abstract
Mänskliga hypofysen adenom (PA) är en gemensam tumör som förekommer i mänskliga hypofysen i hypotalamus-hypofysen-targeted organsystem axel och kan klassificeras som antingen kliniskt funktionella eller icke-funktionella PA (FPA och NFPA). NFPA är svårt för tidigt skede diagnos och terapi på grund av knappt upphöja hormoner i blodet jämfört med FPA. Vårt långsiktiga mål är att använda proteomikmetoder för att upptäcka tillförlitliga biomarkörer för förtydligande av PA molekylära mekanismer och erkännande av effektiva diagnostiska, prognostiska markörer och terapeutiska mål. Effektiv tvådimensionell gelelektrofores (2DE) i kombination med masspektrometri (MS) metoder presenterades här för att analysera människors PA Proteom, inklusive beredning av prover, 2D gelelektrofores, protein visualisering, bildanalys, i-gel trypsin matsmältningen, peptid massa fingeravtryck (PMF) och tandem mass spectrometry (MS/MS). 2-dimensionella gelelektrofores desorption/jonisering masspektrometri med matrix-assisted laser PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS och 2DE-liquid chromatography (LC) MS/MS förfaranden har tillämpats framgångsrikt i en analys av NFPA proteomet. Med användning av en hög känslighet masspektrometer identifierades många proteiner med 2DE-LC-MS/MS metod i varje 2D gel plats i en analys av komplexa PA vävnad att maximera täckningen av mänskliga PA proteomet.
Introduction
PA är en gemensam tumör som förekommer i mänskliga hypofysen i hypotalamus-hypofysen-targeted axis organsystem, som spelar viktiga roller i det mänskliga endokrina systemet. PA innehåller kliniskt funktionella och nonfunctional PAs (FPA och NFPA)1,2. NFPA är svår i tidigt skede diagnos och terapi på grund av endast lätt förhöjda hormonnivåer (t.ex., LH och FSH) i blodet jämfört med FPA, som har betydligt ökade nivåer av motsvarande hormoner i blodet3,4 ,5. Ett förtydligande av molekylära mekanismer och upptäckten av effektiva biomarkörer har viktiga kliniska betydelse i diagnos, behandling och prognos av NFPA. Vårt långsiktiga mål är att utveckla och använda proteomiska metoder för att studera NFPA för upptäckten av tillförlitliga biomarkörer att klargöra dess molekylära mekanismer och identifiera effektiva terapeutiska mål samt diagnostiska och prognostiska markörer. 2-DE tillsammans med MS-metoder har använts flitigt i vårt långsiktiga forskningsprogram angående mänskliga PA proteomet1,2,6,7, inklusive inrättandet av proteomet referens kartor3,8, analys av Differentiellt uttryckta proteinet profiler9,10,11,12,13, hormon varianter14 ,15, post-translationella modifieringar som fosforylering14 och tyrosin nitrering16,17,18, proteomiska variationen av invasiva förhållande till icke-invasiv NFPAs19och proteomiska heterogenitet NFPA subtyper13, vilket ledde till upptäckten av flera viktiga pathway nätverk (mitokondriell dysfunktion, cellcykeln dysreglering, oxidativ stress och MAPK signalering systemet abnormitet) som ändras i NFPA13,19,20.
2De separerar proteiner enligt deras isoelektrisk punkt (pI) (isoelektrisk fokusering, IEF) och molekylvikt (via sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. Detta är en gemensam och klassiskt separation teknik inom proteomik, sedan införandet av begreppen den proteomet och proteomik i 199524. MS är den avgörande tekniken för att ta reda på identiteten på 2DE-separerad proteiner, inklusive strategier för PMF och MS/MS. Den mycket snabba utvecklingen av MS instrument, särskilt i aspekterna av upptäckt känslighet och upplösning, i kombination med förbättringen av LC system, avsevärt förbättrar identiteten på låg eller mycket låg överflöd proteiner i en proteomet att maximera den täckning av en proteomet. Det utmanar också våra traditionella koncept att endast en eller två proteiner finns i en plats i en analys av komplexa mänsklig vävnad proteomet 2D gel och ger en möjlighet att identifiera flera proteiner i en 2D gel plats i en analys av komplexa mänskliga vävnader proteomet och maximera täckningen av NFPA proteomet.
Här beskriver vi detaljerade protokoll av 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS och 2DE-LC-MS/MS som har framgångsrikt använts i analysen av mänskliga NFPA proteomet. Protokollen omfattar beredning av prover, första dimension (isoelektrisk fokusering, IEF), andra dimensionen (SDS-PAGE), visualisering av proteiner (silverfärgning och Coomassie blå färgning), bildanalys av 2D gel, i-gel trypsin matsmältningen, rening av tryptic peptider, PMF, MS/MS och databasen brännande3,8,25,26. Dessutom översätter detta protokoll enkelt för analys av andra mänsklig vävnad proteom.
Protocol
Representative Results
Discussion
2De, tillsammans med MS metoder inklusive 2DE-MS PMF och 2DE-MS/MS, har använts framgångsrikt i vårt långsiktiga program – användning av proteomik för att studera mänskliga NFPA proteomiska variationer och molekylära nätverk variationer för förtydligandet av molekylära mekanismer och upptäckten av effektiva biomarkörer för NFPAs. 2De-baserade jämförande proteomik med bra reproducerbarhet spelar en viktig roll i identifieringen av NFPA proteomiska variationer9,<sup class…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation av Kina (Grant nr 81572278 och 81272798 till XZ), anslag från Kina ”863” planera projektet (Grant No. 2014AA020610-1 till XZ), Xiangya sjukhus medlen för talang introduktion (till XZ) och Hunan Provinsiella naturvetenskap Foundation Kina (Grant No. 14JJ7008 till XZ). Författarna också erkänna det vetenskapliga bidraget av Dr Dominic M. Desiderio i University of Tennessee Health Science Center. X.Z. kontinuerligt utvecklat och använt 2DE-MS metoder för att analysera hypofysen adenom proteomet start från 2001, utformade konceptet för det nuvarande manuskriptet, skrev och reviderade manuskriptet, samordnas relevanta arbetet och var ansvarig för den ekonomiskt stöd och motsvarande arbete. Yl deltog i revision av manuskriptet. Y.H deltog i insamling av referenser och revision av manuskriptet. Alla författare godkänt det slutliga manuskriptet.
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
Referências
- Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
- Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
- Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
- Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
- Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
- Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
- Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
- Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
- Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
- Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
- Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
- Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
- Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
- Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
- Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
- Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
- Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).
