Eletroforese em Gel bidimensional juntamente com métodos de espectrometria de massa para uma análise do proteoma de tecido humano Adenoma de hipófise
Summary
Aqui, apresentamos uma eletroforese em gel bidimensional (2DE) acoplada com espectrometria de massa (MS) para separar e identificar adenoma de hipófise humana tecido proteome, que apresenta um padrão de 2DE bom e reprodutíveis. Muitas proteínas são observadas em cada ponto de 2DE quando analisando proteome complexo de câncer com o uso de MS de alta sensibilidade.
Abstract
Adenoma de hipófise humana (PA) é um tumor comum que ocorre na glândula pituitária humana nos sistemas de eixo hipotálamo-hipófise-alvo do órgão e pode ser classificado como PA clinicamente funcional ou não funcional (FPA e NFPA). NFPA é difícil para o diagnóstico precoce de palco e terapia devido ao mal, elevando hormônios no sangue em comparação com a FPA. O nosso objectivo a longo prazo é usar métodos de proteômica para descobrir biomarcadores confiáveis para o esclarecimento dos mecanismos moleculares de PA e reconhecimento de marcadores eficazes de diagnósticos, prognósticos e alvos terapêuticos. Eletroforese em gel bidimensional eficaz (2DE) juntamente com métodos de espectrometria de massa (MS) foram apresentados aqui para analisar humana proteomes PA, incluindo a preparação de amostras, análise de imagem, em-gel electroforese do gel 2D, visualização de proteína digestão do trypsin, impressão digital em massa de peptídeo (PMF) e em tandem (MS/MS) de espectrometria de massa. 2-dimensional gel de electroforese do laser assistida por matriz dessorção/ionização espectrometria de massa PMF (2DE MALDI MS PMF), 2DE MALDI MS/MS e os procedimentos de MS/MS cromatografia líquido-2DE (LC) foi aplicado com sucesso em uma análise do proteoma NFPA. Com o uso de um espectrômetro de massa de alta sensibilidade, muitas proteínas foram identificadas com o método de 2DE-LC-MS/MS em cada ponto em uma análise do tecido complexo de PA para maximizar a cobertura de proteome humano de PA de gel 2D.
Introduction
PA é um tumor comum que ocorre na glândula pituitária humana nos sistemas eixo hipotálamo-hipófise-alvo do órgão, que desempenham importantes funções no sistema endócrino humano. PA inclui funcionais e clinicamente PAs (FPA e NFPA)1,2. NFPA é difícil no início fase de diagnóstico e terapia por causa dos níveis de hormônio apenas ligeiramente elevada (por exemplo, LH e FSH) no sangue em comparação com FPA, que aumentou significativamente os níveis de hormônios correspondentes no sangue3,4 ,5. O esclarecimento dos mecanismos moleculares e descoberta de biomarcadores eficazes tem significado clínico importante no diagnóstico, terapêutica e prognóstico da NFPA. O nosso objectivo a longo prazo é desenvolver e usar métodos de proteomic estudar NFPA para a descoberta de biomarcadores confiáveis para esclarecer seus mecanismos moleculares, e reconhecer alvos terapêuticos eficazes, bem como marcadores de diagnósticos e prognósticos. 2-DE juntamente com MS métodos têm sido utilizados extensivamente em nosso programa de investigação a longo prazo em matéria humana PA proteome1,2,6,7, incluindo o estabelecimento de referência proteome mapas de3,8, análise de proteínas diferencialmente expressos perfis9,10,11,12,13, variantes de hormônio14 ,15, modificações borne-translational como fosforilação14 e tirosina nitração16,17,18, a variação de proteomic de invasoras relativo a não-invasiva NFPAs19e a heterogeneidade de proteomic do NFPA subtipos13, que levou à descoberta de várias redes de importante via (disfunção mitocondrial, desregulação do ciclo celular, estresse oxidativo e MAPK sinalização anormalidade do sistema) que são alteradas em NFPA13,19,20.
2DE separa as proteínas de acordo com seu ponto isoelétrico (pI) (isoeléctrica, IEF) e o peso molecular (através de sódio Dodecil sulfato poliacrilamida electroforese do gel, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. esta é uma técnica de separação comum e clássico no campo da proteômica, desde a introdução dos conceitos do proteoma e proteômica em 199524. MS é a técnica fundamental para descobrir a identidade de proteínas 2DE separada, incluindo estratégias PMF e MS/MS. O desenvolvimento muito rápido dos instrumentos de MS, especialmente nos aspectos de sensibilidade detecção e resolução, em combinação com a melhoria do sistema de LC, melhora consideravelmente a identidade das proteínas de baixa ou extremamente baixa abundância em um proteome para maximizar o cobertura de um proteome. Ele também desafia nossos conceitos tradicionais que apenas uma ou duas proteínas estão presentes em um gel 2D em uma análise do complexo tecido humano proteome local e oferece uma oportunidade para identificar várias proteínas em um ponto em uma análise do tecido humano complexo de gel 2D proteoma e maximizar a cobertura de proteome NFPA.
Aqui descrevemos protocolos detalhados de 2DE MALDI MS do DPP, 2DE MALDI MS/MS e 2DE-LC-MS/MS, que tem sido utilizada com sucesso na análise do proteoma humana de NFPA. Os protocolos incluem a preparação de amostras, primeiro dimensão (isoeléctrica, IEF), segunda dimensão (SDS-PAGE), visualização de proteínas (coloração prata e azul de Coomassie coloração), análise de gel 2D, digestão de tripsina em gel, da imagem purificação de peptídeos tryptic, PMF, MS/MS e banco de dados Cauterizante3,8,25,26. Além disso, este protocolo traduz facilmente para a análise de outros proteomes de tecido humano.
Protocol
Representative Results
Discussion
2DE, juntamente com métodos MS incluindo 2DE-MS PMF e 2DE-MS/MS, tem sido utilizado com sucesso em nosso programa de longo prazo – o uso da proteômica para estudar variações de proteomic humanas NFPA e variações de rede molecular para a elucidação dos mecanismos moleculares e descoberta de biomarcadores eficazes para NFPAs. Baseado em 2DE proteômica comparativa com boa reprodutibilidade desempenha um papel importante na identificação de NFPA proteomic variações9,<sup class=…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant n. º 81572278 e 81272798 para XZ), as bolsas da China “863” plano de projeto (Grant No. 2014AA020610-1 a XZ), os fundos do Hospital de Xiangya para talento Introduçãoà (XZ) e a Hunan Fundação provincial de ciências naturais da China (14JJ7008 No. Grant para XZ). Os autores também reconhecem a contribuição científica do Dr. Dominic M. Desiderio em centro de Ciências de saúde Universidade do Tennessee. X.Z. continuamente desenvolvido e usado métodos 2DE-MS para analisar proteome adenoma de hipófise a partir de 2001, concebeu o conceito para o presente manuscrito, escreveu e revisto o manuscrito, coordenou o trabalho pertinente e foi responsável para a apoio financeiro e trabalho correspondente. Y.L. participou na revisão do manuscrito. YH participou na coleção de referências e revisão do manuscrito. Todos os autores aprovaram o manuscrito final.
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
Referências
- Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
- Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
- Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
- Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
- Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
- Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
- Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
- Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
- Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
- Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
- Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
- Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
- Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
- Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
- Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
- Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
- Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).
