Zweidimensionaler Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie Methoden für eine Analyse der menschlichen Hypophyse Adenom Gewebe Proteom
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) zu trennen und menschlichen Hypophysen Adenom Gewebe Proteom, stellt eine gute und reproduzierbare 2DE Muster identifizieren. Viele Proteine werden in jedem 2DE Fleck beobachtet, bei der Analyse von komplexen Krebs Proteome mit dem Einsatz von hochempfindlichen MS.
Abstract
Menschlichen Hypophysen Adenom (PA) ist ein gemeinsames Tumor, der tritt in der menschlichen Hypophyse in der Hypothalamus-Hypophysen-bezogene Achse Organsysteme, und kann als klinisch funktionsfähig oder nicht funktionsfähige PA (FPA und NFPA) eingestuft werden. NFPA ist schwierig für Bühne Frühdiagnostik und Therapie durch Hormone im Blut im Vergleich zu FPA kaum erhöhen. Unser langfristige Ziel ist es, Proteomics Methoden verwenden, um verlässliche Biomarker zur Klärung der PA molekularen Mechanismen und Anerkennung der effektive diagnostische, prognostische Marker und therapeutischen Ziele zu entdecken. Effektive zweidimensionaler Gelelektrophorese (2DE) gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) Methoden wurden hier vorgestellt, um menschliche PA Proteome, einschließlich Vorbereitung von Proben, 2D Gelelektrophorese, Protein-Visualisierung, Bildanalyse, in-Gel zu analysieren Trypsin-Verdauung, Peptid Masse Fingerabdruck (PMF) und Tandem Massenspektrometrie (MS/MS). 2-dimensionale Gel-Elektrophorese Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie PMF (2DE MALDI-MS-PMF), 2DE MALDI-MS/MS und 2DE-Liquid Chromatographie (LC)-MS/MS-Verfahren zur Analyse der NFPA Proteom erfolgreich angewendet wurden. Mit dem Einsatz eines Massenspektrometers hochempfindlichen wurden viele Proteine mit 2DE-LC-MS/MS-Methode in jedes 2D Gel vor Ort in einer Analyse der komplexen PA-Gewebe um die Deckung des menschlichen Proteoms PA zu maximieren identifiziert.
Introduction
PA ist ein gemeinsames Tumor, der Auftritt in der menschlichen Hypophyse in der Hypothalamus-Hypophysen-bezogene Achse Organsysteme, die in das menschliche Hormonsystem eine wichtige Rolle spielen. PA enthält klinisch funktionelle und nicht funktionsfähige PAs (FPA und NFPA)1,2. NFPA ist im frühen Stadium-Diagnose und Therapie schwierig, weil nur leicht erhöhten Hormonspiegel im Blut im Vergleich zu FPA, die Ebenen der entsprechenden Hormone im Blut3,4 deutlich zugenommen hat (z.B.LH und FSH) ,5. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen und Entdeckung der effektive Biomarker hat wichtigen klinische Bedeutung in der Diagnostik, Therapie und Prognose der NFPA. Unser langfristige Ziel ist es, entwickeln und Proteomik Methoden verwenden, um NFPA für die Entdeckung der verlässliche Biomarker zu klären, die molekularen Mechanismen zu untersuchen und wirksame therapeutische Targets sowie diagnostische und prognostische Marker zu erkennen. 2-DE gepaart mit MS Methoden worden ausführlich in unserer langfristigen Forschungsprogramms über menschliche PA Proteom1,2,6,7, einschließlich Errichtung des Proteoms Referenz benutzt 3,8, Analyse differentiell exprimierten Protein Profile9,10,11,12,13, Hormon-Varianten14 Karten ,15, post-translationalen Modifikationen wie Phosphorylierung14 und Tyrosin Nitrierung16,17,18, die Proteomik-Variation der invasiven relativ zu nicht-invasive NFPAs19und der Proteomik Heterogenität der NFPA Subtypen13, führte zu die Entdeckung mehrerer wichtiger Signalweg Netze (mitochondriale Dysfunktion, Zellzyklus Dysregulation, oxidativen Stress und MAPK signaling System-Anomalie), NFPA13,19,20verändert werden.
2de trennt Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) (isoelektrischen Fokussierung, IEF) und Molekulargewicht (über Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. Dies ist eine gemeinsame und klassische Trennung Technik im Bereich der Proteomik, seit der Einführung der Konzepte der Proteom und Proteomics in 199524. MS ist die entscheidende Technik um herauszufinden, die Identität des 2DE getrennt Proteine, einschließlich PMF und MS/MS-Strategien. Die sehr rasche Entwicklung der MS Instrumente, insbesondere die Aspekte der Empfindlichkeit und Auflösung, in Kombination mit der Verbesserung der LC-System verbessert die Identität des gering oder sehr gering Fülle Proteine in einem Proteomforschung zur Maximierung der Berichterstattung über ein Proteome. Es fordert auch unsere traditionelle Konzepte, dass nur ein oder zwei Proteine befinden sich in einem 2D Gel vor Ort in einer Analyse der komplexen menschlichen Gewebes Proteom und bietet die Möglichkeit, mehrere Proteine in einem 2D Gel vor Ort in einer Analyse des komplexen menschlichen Gewebes zu identifizieren Proteome und maximieren Sie die Abdeckung des NFPA Proteoms.
Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle der 2DE MALDI-MS-PMF, 2DE MALDI-MS/MS und 2DE-LC-MS/MS, die erfolgreich in der Analyse des menschlichen Proteoms NFPA verwendet wurden. Die Protokolle sind Vorbereitung von Proben, zunächst Bemaßung (isoelektrischen Fokussierung, IEF), zweite Dimension (SDS-PAGE), Visualisierung von Proteinen (silberne Färbung und Coomassie blaue Färbung), Bildanalyse von 2D Gel, in Gel Trypsin-Verdauung Reinigung von tryptic Peptide, PMF, MS/MS und anbraten3,8,25,26-Datenbank. Darüber hinaus übersetzt dieses Protokolls leicht für die Analyse von anderen menschlichen Gewebes Proteome.
Protocol
Representative Results
Discussion
2de, gepaart mit MS Methoden einschließlich 2DE-MS PMF und 2DE-MS/MS, erfolgreich eingesetzt in unserem langfristigen Programm – die Verwendung von Proteomics, menschliche NFPA Proteomic Variationen und molekulare Netzwerk Variationen für die Aufklärung der molekularen Mechanismen zu studieren und Entdeckung der effektive Biomarker für NFPAs. 2de basierte vergleichende Proteomik mit gute Reproduzierbarkeit spielt eine wichtige Rolle bei der Identifizierung von NFPA Proteomic Variationen9,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation von China (Grant Nr. 81572278 und 81272798 zur XZ), die Zuschüsse aus der Hunan, China “863” Plan-Projekt (Grant No. 2014AA020610-1, XZ) und die Xiangya Krankenhaus Fonds für Talent (XZ) unterstützt. Provinzielle Natural Science Foundation von China (Grant No. 14JJ7008, XZ). Die Autoren erkennen auch die wissenschaftliche Beiträge von Dr. Dominic M. Desiderio in der University of Tennessee Health Science Center. X.Z. kontinuierlich entwickelt und 2DE-MS-Methoden verwendet, um die Hypophyse Adenom Proteom ab 2001 zu analysieren, konzipiert das Konzept für das vorliegende Manuskript, schrieb das Manuskript überarbeitet, koordinierte die einschlägige Arbeit und war verantwortlich für die finanzielle Unterstützung und entsprechende Arbeit. YL beteiligte sich an der Überarbeitung des Manuskripts. YH teilgenommen Sammlung von Referenzen und Überarbeitung des Manuskripts. Alle Autoren genehmigt das endgültige Manuskript.
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
Referências
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