Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

إنشاء مقايسة الاستعمار الرئة لتعميم التصور خلية الورم في أنسجة الرئة

Published: June 16, 2018 doi: 10.3791/56761
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1, 1, 3, 1,2
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Trauma Office, Children's National Health System

Summary

نموذج حيوان ضروري لفك دور تعميم الخلايا السرطانية (ريادية) في تعزيز استعمار الرئة أثناء سرطان خبيث. هنا، قمنا بإنشاء وتنفيذها بنجاح في فيفو الاعتداء على وجه التحديد اختبار اشتراط الجمعية فيبرونيكتين البوليمرية (بوليفن) على ريادية لاستعمار الرئة.

Abstract

ورم خبيث هو السبب الرئيسي للوفاة من السرطان. دور تعميم الخلايا السرطانية (ريادية) في الترويج لسرطان خبيث، الذي يساهم في الرئة الاستعمار ريادية خطيرة على عمليات المنتشر الرئة المبكر، تم التحقيق بشدة. على هذا النحو، النماذج الحيوانية هي النهج الوحيد الذي يلتقط عملية منهجية كاملة لورم خبيث. نظراً لأن المشاكل تحدث في التصاميم التجريبية السابقة لدراسة إسهامات ريادية للتسرب الأوعية الدموية، قمنا بإنشاء في فيفو الرئة استعمار مقايسة التي طويلة الأجل-الأسفار الخلية-الراسم، كاربوكسيفلوريسسين إستر سوكسينيميديل (CFSE)، تم استخدامه لتسمية الخلايا السرطانية مع وقف التنفيذ، وقد أنجز نضح الرئة لمسح غير تحديداً المحاصرين ريادية قبل إزالة الرئة والتصوير [كنفوكل]، والتقدير الكمي. تم العثور على فيبرونيكتين البوليمرية (بوليفن) اجتمعنا للأسطح لجنة مكافحة الإرهاب التوسط من أجل استعمار الرئة في النهائي إنشاء أنسجة الورم المنتشر. وهنا على وجه التحديد اختبار شرط الجمعية بوليفن على ريادية لاستعمار الرئة والتسرب، أجرينا قصير فحوصات الرئة الاستعمار التي علقت خلايا سرطان الرئة لويس (المسئولية) ستابلي معربا عن الجبهة الوطنية-شرنا (شفن) أو التدافع-شرنا (شسكر) والمسمى مسبقاً مع 20 ميكرو كفسي تم تلقيح عن طريق الوريد في الفئران C57BL/6. أننا نجح في إثبات أن قدرات شفن LLC الخلايا لاستعمار الرئتين الماوس تتضاءل إلى حد كبير بالمقارنة مع الخلايا شسكر LLC. ولذلك، هذه المنهجية القصيرة الأجل قد تطبق على نطاق واسع لإثبات قدرة ريادية داخل الدورة الدموية لاستعمار الرئتين على وجه التحديد.

Introduction

ورم خبيث هو السبب الرئيسي للسرطان الموت1،2. أدخل على تداول في تعليق الخلايا السرطانية المستمدة من الأنسجة الأولية والبقاء على قيد الحياة مختلف عن التحديات، مثلاً، anoikis، ومحصنة ضد الاعتداءات والأضرار نتيجة لإجهاد القص من ضغط الدم أو القيود هندسية، قبل أن تكون القدرة على استعمار الأجهزة البعيدة، خطوة أساسية في إملاء نجاح خبيث3،4،،من56. ولذلك، قد حاليا تم بذل جهود نشطة في تميز الخلايا السرطانية المتداولة (ريادية) وربط هذه الخصائص مع الورم الخبيث، وورم خبيث، ومعدلات البقاء على قيد الحياة لمرضى السرطان7،8 , 9-منذ عملية سرطان خبيث على وجه التحديد يصور حدثاً في فيفو ، نماذج حيوانية هي النهج الوحيد الذي يلتقط عملية منهجية كاملة لورم خبيث10،11،12 .

تصبح ريادية أنسجة الورم المنتشر من خلال أحداث الخلوية متعددة بما في ذلك استعمار الأجهزة البعيدة1،2. ومع ذلك، لا توفر خبيث الأكثر استخداماً فحوصات13،،من1415 وسيلة لمراقبة لجنة مكافحة الإرهاب استعمار الأجهزة البعيدة. ولذلك، حاجة ملحة في فيفو مقايسة تصميم للتصور الاستعمار لجنة مكافحة الإرهاب. على الرغم من أن عدة في فيفو و السابقين فيفو قصيرة الأجل الرئة الاستعمار وقد تم تصميم الاختبارات ومشاكل وعيوب تظل. على سبيل المثال، بينما البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)-فحوصات overexpressing ورم الخلايا التي استخدمت في هذه،من2223، ويستغرق وقتاً ستابلي ترانسفيكت واستنساخ الخلايا السرطانية مع كافية شدة الفلورسنت بروتينات فلورية خضراء تحت المجهر. وبالمثل، قد استخدمت تلطيخ عابر للخلايا السرطانية مع الراسم خلية طويل الأجل كفسي ليحل محل الخلايا السرطانية معربا عن التجارة والنقل، ولكنها لا تزال صعوبة في الحكم على ما إذا كانت خلايا السرطان المسمى كفسي مرفقة أو مجرد موجودة داخل المفرج من ال16،الأجهزة البعيدة قصت17.

تم العثور على فيبرونيكتين البوليمرية (بوليفن) المجمعة على أسطح ريادية المساهمة حاسمة في إقامة النهائي للورم المنتشر الأنسجة18،19،،من2021،22 . هنا، نحن إجراء قصير تم تلقيح الرئة الاستعمار فحوصات في أي تعليق لويس خلايا سرطان الرئة (المسئولية) ستابلي معربا عن الجبهة الوطنية-شرنا (شفن) أو التدافع-شرنا (شسكر) والمسمى مسبقاً مع كفسي عن طريق الوريد في الفئران C57BL/6. بعد 2-3 أيام، كانت أول perfused الرئتين الماوس مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإزالة فاتحة ريادية ضمن المفرج قبل أن يتعرض للفحص المجهري [كنفوكل] والتحديد الكمي لاستعمار الرئة المسئولية. لقد تبين بوضوح أن أعدادا من استعمار الرئة شفن المسئولية والعقيدات الورم خفضت إلى حد كبير بالمقارنة مع شسكر المسئولية، مساندة دور الجمعية بوليفن على ريادية إلى حد كبير في تسهيل الاستعمار ونمو ريادية في الرئتين. دراستنا يستحق مزيدا من التحقيق للدور بوليفن في سرطان خبيث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب التي أجريت على الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية لمعهدنا (دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، وكلية طب NCKU).

1-إعداد أدوات ووسائط الثقافة وأطباق

  1. قبل البدء في البروتوكولات التجريبية، الحصول على خيوط الجراحة المعقمة، 1 مل الحقن بالإبر ز 26/0.5 سم (لحقن الوريد الذيل)، 3 مل المحاقن مع الإبرة 24 غ/سم 3 (لنضح الرئة)، تعديل النسر وسائط الإعلام (دميم دولبيكو)، التربسين-يدتا الحل (5 التربسين غرام/لتر و 0.53 ملم)، المصل البقري الجنين (FBS) وبرنامج تلفزيوني x 1 (137 مم كلوريد الصوديوم و 2.7 مم بوكل، ملم 10 غ2بو4و 1.8 مم خ2ص4) وأطباق الثقافة 6 سم.

2-إعداد واستعادة الخلايا السرطانية في تعليق

  1. إعداد تعديل النسر وسائط الإعلام (دميم العقيمة دولبيكو) التي تحتوي على نسبة 10% أو 20% FBS وطازجة إضافة 2 مم L-الجلوتامين وبرنامج تلفزيوني x 1 0.05% يدتا التربسين.
  2. الثقافة الخلايا في دميم وتستكمل مع 10% FBS في 37 درجة مئوية وتنمو لهم حتى يكون هناك التقاء 70-80% في الطبق الثقافة.
  3. قم بإزالة وسائط الثقافة (دميم) من الأطباق، تليها يغسل اثنين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني x 1 العقيمة.
  4. أضف 1 مل من 0.05% يدتا التربسين في الأطباق صورة شاملة تغطي كافة الخلايا. فورا إزالة 800 ميكروليتر من الحل وترك فقط 200 ميكروليتر في الأطباق. احتضان الأطباق في 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة (تبعاً لنوع الخلية) وانتظر حتى غالبيتهم من الخلايا في حالة تعليق.
  5. أضف 1 مل دميم الطازجة التي تحتوي على 10% FBS مباشرة في الأطباق وقف النشاط الأنزيمي من التربسين وبقوة "الماصة؛" تعليق خلية صعودا وهبوطاً مع ماصة 1000 ميليلتر لإعداد تعليق خلية مفردة.
  6. نقل الخلايا من الطبق إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، وتدور أسفل الخلايا في درجة حرارة الغرفة في 162 س ز لمدة 3 دقائق.
  7. نضح المادة طافية وتدوير ريسوسبيند الورم الخلايا في 1.5 مل دميم الذي يحتوي على 20% FBS ونهاية أكثر من الخلايا في تعليق على 37 درجة مئوية ح 2.
    ملاحظة: إذا كان المتوسط يتحول إلى اللون الأصفر أثناء الاسترداد، تبادل المتوسطة القديمة مع الطازجة المتوسطة التي تحتوي على 20% FBS.

3-الأسفار تلطيخ وتحليل الخلايا السرطانية في تعليق مع إستر سوكسينيميديل "كاربوكسيفلوريسسين" (CFSE)

  1. بعد استعادة خلية في تعليق، عد الأرقام المناسبة خلية قابلة للبقاء مع تريبان الأزرق في نويباور العد الدائرة للمعايرة fluorescence تلطيخ جرعات وذيل لحقن الوريد.
  2. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في ز 162 x في درجة حرارة الغرفة 3 دقيقة وريسوسبيند الخلايا الأعلاف في 1 مل من تعقيم 1 x PBS، متبوعاً بالطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة في 162 س ز لمدة 3 دقائق.
  3. ريسوسبيند الخلايا الأعلاف في 500 ميليلتر من 1 X PBS تحتوي على 10% FBS و 0، 5، 10، 20 أو 40 ميكرومتر كفسي لمعايرة الجرعات، واحتضان تعليق خلية في 37 سج ل 10 دقيقة في الظلام.
  4. وتدور أسفل الخلايا في 162 س ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق ريسوسبيند الخلايا الأعلاف مع 4 مل دميم الذي يحتوي على 1% FBS. كرر هذه الخطوة الغسيل ثلاث مرات أكثر. ريسوسبيند الخلايا الأعلاف مع 4 مل دميم وحدها للغسيل نهائياً.
  5. تخضع الخلايا المسماة كفسي للأسفار تنشيط الخلية الفرز التحليل (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لقياس كثافة الأسفار من خلية واحدة، أو ذيل حقن الوريد.
    ملاحظة: الاحتفاظ الخلايا على الجليد قبل تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل أو ذيل حقن الوريد.

4-الرئة الاستعمار الإنزيم

  1. إعداد الخلايا المسماة مع 20 ميكرومتر كفسي (الرجوع إلى خطوات 3.1 خلال 3، 4).
    ملاحظة: تقرر جرعة كفسي العامل لوضع العلامات الخلايا السرطانية، استناداً إلى نتائج المعايرة من خلال تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية (أرجع إلى الخطوة 3، 3).
  2. الاحماء الذيول من 4-6 أسابيع-الفئران C57BL/6 القديمة الذكور (6 الفئران) مع مصباح هاليد لمدة 5-10 دقيقة على أساس الماوس بالماوس لتمدد الأوردة ذيل الماوس.
  3. دقة المزيج ونضح الخلايا السرطانية المسمى كفسي مع حقنه 1 مل (26Gx1/2)، تجنب أي فقاعات في تعليق خلية (بكثافة خلية الأخيرة من 5 × 106 خلايا/مل).
  4. حقن بعناية 1 x10 خلايا الورم المسمى كفسي6 في 200 ميليلتر من دميم في السياق ذيل الماوس، الذي يجب أن يودع في ريسترينير ماوس.
    ملاحظة: أثناء الحقن، إذا وضعت الإبرة مباشرة في التجويف الوريد الذيل، ورم الخلايا ينبغي بسهولة تسليم إلى الدورة الدموية دون الحاجة إلى دفع الثابت في المحاقن. إذا كان من الصعب دفع الخلايا السرطانية من خلال، أنهم قد تم حقن خارج السياق الذيل، على الأرجح في الفضاء تحت الجلد.
  5. تقسيم الفئران التي تلقت الخلايا الورم المسمى كفسي عن طريق الوريد إلى مجموعتين: مجموعة واحدة سيخضع نضح الرئة تليها مجهرية [كنفوكل] وسيتم ترك ImageJ الكمي في التحليل الاستعمار الرئة والآخر وحدها إلى 4-5 الاعتداء أسابيع في استعمار الرئة طويلة الأجل.
  6. الساعة 20، 38، أو ح 45، ومع الخلايا السرطانية 1 × 106 حقن الوريد أثناء معايرة تعتمد على دورة وجرعة مرة تخدير الفئران الحاملة للورم مع 50-75 مغ/كغ زوليتيل 50، وهو أنيسثيتيزير سليمة ومقبولة جيدا23.
    ملاحظة: استخدام مرهم البيطرية في العيون للفئران لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  7. طوليا قطع الجلد والأنسجة تحت الجلد من البطن إلى منطقة الصدر مع المقص الجراحي. فتح التجويف الجنبي بالمقص الجراحي والملقط للكشف تماما عن القلب والرئتين.
    ملاحظة: كن حذراً لتجنب قطع الأوعية الدموية.
  8. التعادل متفوقة الوريد الأجوف (SVC) وأدنى الوريد الأجوف (IVC) بخيوط الجراحة المعقمة لمنع الدفق من نضح الحل خلال نضح الرئة.
  9. قطع جدار البطين الأيسر مع المقص الجراحي لفتح الشق (حوالي 2-4 مم) استنزاف الحل نضح من الرئتين.
  10. حقن 1 x برنامج تلفزيوني في البطين الأيمن مع حقنه 3 مل وإزالة الحل المصفى مع الشفط المستمر خلال نضح الرئة حتى الرئتين بدوره من لون ضارب إلى الحمرة إلى بالي تماما.

5-[كنفوكل] تصوير مجهرية وتحليل الخلايا السرطانية التي استعمرت الرئة

  1. إزالة الرئتين بالي الآن من التجويف الجنبي وفصل الفصوص خمس قطع الأربطة القصبة الهوائية والأنسجة الضامة مع مقص وملقط الجراحة24بعيداً.
  2. إعداد حامل نقالة تشبه الرئة كما هو موضح في الشكل 3 باللف خياطة نايلون حول اثنين من قضبان معدنية لإنتاج نسيج متشابك مع وضع مسافة بين قضبان اثنين لموضع فصوص الرئة. تعيين صاحب الرئة في طبق 6 سم.
    ملاحظة: سيتم استخدام حامل الرئة على استقرار الفصوص الرئة تحت عدسة المجهر [كنفوكل] الهدف.
  3. لودج، وإصلاح الفصوص الرئة على نسيج متشابك من صاحب الرئة. تغطية وترطيب الفصوص الرئة مع 1 x PBS.
  4. الموضوع الطبق 6-سم الثقافة إيواء الفصوص الرئة على حامل الرئة للفحص المجهري [كنفوكل] لالتقاط الصور fluorescence تسجيل الخلايا السرطانية استعمار الرئة.
  5. للتصوير، واستخدام عدسات الهدف (5 س، مبلن، نا: WD 0.1،: 20، الهواء).
  6. قم بتدوير عجلة تصفية لنبأ (الإثارة/الانبعاثات؛ 470-495 نيوتن متر/510-550 نانومتر) واستخدام ليزر 488 نانومتر لإثارة كفسي، لوضوح تصور صور نقاط fluorescence في فصوص الرئة.
  7. قم بتدوير عجلة عامل التصفية إلى R690 (بالنسبة لليزر مايتي HP دبس) لمسح مع 2.0 بيكسل المايكروثانيه المسح الضوئي بسرعة وتحسين الجيش الكرواتي، والكسب، وإزاحة مستويات.
  8. التقاط الصور الفلورية (512 × 512 بكسل) باستخدام برنامج المجهر مع 10 بيكسل المايكروثانيه سرعة المسح الضوئي.
  9. قياس وتحليل الصور المجهرية باستخدام البرمجيات إيماجيج وجرافباد كما هو موضح سابقا21إحصائيا.

6-طويلة الأجل فحوصات الاستعمار الرئة

ملاحظة: تكرار الخطوات من 4.1 من خلال 4.5.

  1. التضحية الفئران بعد تلقيح خلايا الورم لمدة 4-5 أسابيع وإصلاح على الرئتين ب السوائل بوين في25 للأيام 1 إلى 2.
  2. قياس وتحليل إحصائيا العقيدات الورم من الرئتين الفئران مع البرمجيات21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قبل إجراء الفحص الاستعمار الرئة في فيفو كما هو موضح في الشكل 1A اختبار ما إذا كان يتوسط بوليفن على الخلايا السرطانية مع وقف التنفيذ الاستعمار الرئة و/أو التسرب في تيسير ورم خبيث، ونحن أولاً معاير مختلفة تركيزات كفسي، مجمع فلورسنت نفاذية الخلية وتساهمي يرتبط داخل الخلايا المحتوية على أمين جزيئات26،27 في الخلايا السرطانية مع وقف التنفيذ ويبقى في الخلايا لفترة طويلة من الزمن. ووجدنا أن ورم الخلايا كانت فعالية المسمى مع كفسي بطريقة تعتمد على الجرعة، كما هو مبين في الشكل 1 باء. كفسي العلامات في 6 x105 ذ خلايا/مل تقريبا التوصل إلى هضبة في 20 ميكرومتر كما يتضح في الشكل 1.

نظراً لوفرة ضاقت الشعرية النظام فعلياً قد تعرقل تدفق ريادية ضمن المفرج الرئة، أجرينا الرئة التروية في الفئران التي تحمل حقن الوريد المسمى كفسي LLC الخلايا لمسح غير تحديداً ريادية المحاصرين، كما ويوضح الشكل 1A قبل إزالة الرئة عند كل نقطة الوقت كما هو مبين في الشكل 4. قبل التروية، الرئتين بوضوح المحمر بسبب وجود الدم، كما هو موضح في اللوحة اليسرى الرقم 2. وأصبح الرئتين شاحب بعد التروية مع 10-15 مل من 1 x PBS، كما هو موضح في اللوحة اليمنى الشكل 2.

فورا بعد أن أزيلت الرئتين perfused ماوس من الحيز الجنبي، فصل الفصوص الرئة ومثبتة على حامل الرئة توضع في الأطباق كما هو موضح في الشكل 3 ألف مع PBS x 1 شاملة تغطي الفصوص الرئة. فصوص الرئة مثبتة على حامل الرئة كما هو موضح في الشكل 3B تعرضوا للفحص المجهري الأسفار [كنفوكل] كما هو موضح في الشكل 3 ألف. تم تصويرها الخلايا السرطانية المسمى كفسي استعمار الرئتين كما هو موضح في اللوحة العلوية الرقم 3 وتحولت إلى صور الأبيض والأسود كما هو موضح في الفريق أقل من رقم 3 لتسهيل التحديد الكمي لاستعمار الرئة مع البرمجيات "ي الصورة".

نحن حقن الوريد شسكر أو شفن LLC الخلايا التي وصفت مع 20 ميكرومتر كفسي وانتظر دورة وقت من 24-72 ساعة قبل تنفيذ بيرفوسيونس الرئة والتصوير المجهري [كنفوكل]. التحديد الكمي لاستعمار الرئة ورم الخلايا في الفئران 6 كما هو موضح في الشكل 4A مع البرمجيات ImageJ كشفت أن كثيرا شفن LLC خلايا أقل من الخلايا شسكر LLC أحصى في ح 38 والنقاط الزمنية ح 45، كما هو موضح في الشكل 4B . والسبب لماذا كان عدد شسكر استعمرت الرئة وخلايا LLC شفن تقل تدريجيا من المرجح جداً بسبب سيتوتوكسيسيتي متواصلة تمارسها حصانة على تداول حتى ضد الخلايا LLC الفعل المستعمر. بالإجمال، تشير هذه النتائج بوليفن أن المجتمعين على ريادية مطلوب فعلا في التوسط لاستعمار الرئة من ذ الخلايا، مما يؤدي إلى ورم خبيث كاملة في الرئتين كما يتبين من النتائج التي الفئران بعض عن طريق الوريد تلقي مختبرين وتركت المسمى كفسي شسكر وشفن LLC الخلايا لفحوصات الاستعمار الرئة كما هو موضح في الشكل 4 ورم الرئة الونيونتيل ووضعت العقيدات في مقايسة خبيث الورم التجريبية كما هو موضح في الشكل 5 ألف و 5B-

Figure 1
رقم 1: معايرة تركيزات كفسي لتسمية الخلايا السرطانية في مقايسة الاستعمار الرئة. (أ) التوضيح التخطيطي لإجراءات الفحص الاستعمار الرئة والمقايسة خبيث التجريبية كما هو مفصل في المقطع بروتوكولات. (ب) تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية كثافات fluorescence كفسي LLC الخلايا التي كانت ملطخة بتركيزات مختلفة من كفسي. (ج) تم رسم كثافات Fluorescence كوظائف مختلف كفسي تركيزات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الرئتين قبل وبعد التروية. صور الممثل للرئتين قبل (أونبيرفوسيد؛ أونبيرف.) وبعد (perfused؛ Perf.) أداء نضح الرئة. نجمة ذهبية: القلب. السهم الأبيض: التعادل التي أغلقت IVC/SVC. الأسهم الحمراء: الرئتين الماوس نفسها قبل وبعد التروية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تركيب الفصوص الرئة perfused على حامل الرئة للأسفار [كنفوكل] مجهرية. (أ) نظام للرئة-التركيب على حامل الرئة للفحص المجهري [كنفوكل]. (ب) صورة تمثيلية من 3 فصوص الرئة perfused على حامل الرئة. (ج) صور الممثل لاستعمار الرئة خلايا LLC مع الأسفار كفسي للقياس الكمي بالبرنامج "ي الصورة". اللوحة العلوية: التصوير العادية. لوحة أسفل: عكس التصوير باللونين الأبيض والأسود. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: وقت دورة التصوير والتقدير الكمي، والتحليل الإحصائي للرئة استعمرت شسكر وشفن LLC الخلايا بعد نضح الرئة في مقايسة الاستعمار الرئة. (أ) الممثل صور الأبيض والأسود (تحويلها من الصور الفلورية) شسكر وشفن LLC الخلايا التي كانت مستعمرة في المفرج الرئة في نقاط زمنية مختلفة كما صورت بعد نضح الرئة واسعة النطاق. تدل الخطوط المنقطة حافة مناطق أنسجة الرئة [كنفوكل] في التركيز. (ب) التحديد الكمي والتحليل الإحصائي لخلايا الرئة استعمار LLC كتصور في (أ) بمتوسط 5 صور الممثل المطلق/الرئة الفص/الماوس. ملاحظة: كل شريط يشير إلى شدة الأسفار متوسط كل مجال [كنفوكل] في التركيز. المعطيات إحصائيا حلل من الفئران 6 وذكرت يعني ± التنمية المستدامة؛ يعني نوفاسكوتيا المساحات؛ * يعني ف < 0.05؛ و * * يعني ف < 0.01؛ ANOVA ثنائي الاتجاه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: إسكات التعبير FN في الخلايا المسماة كفسي LLC يقلل العقيدات ورم في الرئتين على المدى الطويل في فيفو مقايسة الاستعمار لجنة مكافحة الإرهاب- الرئتين الماوس السائل--ثابت (A) بوين إذ تضع العقيدات الورم المستمدة من المسمى كفسي شسكر أو شفن LLC الخلايا. (ب) التحديد الكمي والتحليل الإحصائي للعقيدات ورم في الرئتين. وترد البيانات يعني ± التنمية المستدامة؛ : p < 0.001؛ n = 6 كل مجموعة؛ اختبار t مزاوج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

جنبا إلى جنب مع طويلة الأجل الرئة الاستعمار فحوصات، على المدى القصير المنهجية المتبعة ونحن هنا لتقييم الاستعمار في فيفو الرئة بريادية في الأجهزة البعيدة كشفت بوضوح ويميز الدور المحدد لتجميعها في ريادية في استعمار بوليفن الرئتين، مما أدى بعد ذلك إلى التسرب وعمليات المنتشر18،19،،من2021. على الرغم من أن تسمية الخلايا مع تعقب خلية طويل الأجل كفسي سمح لنا بتتبع ريادية حقن الوريد لمدة تصل إلى ثلاثة أيام قبل نضح الرئة وتحتفظ الفلورية الخضراء كافية لأغراض الكمية، كان من المستحيل تحديد مباشر ما إذا كانت الخلايا السرطانية تقع داخل التجويف السفينة أو كان بالفعل اكسترافاساتيد من الأوعية الدموية. لحل هذه المشكلة، أحمر فلوري ديكستران والرودامين مترافق وقادرة على ربط غير تحديداً إلى ليكتينس عن الجهاز يمكن أن تستخدم لتسمية المفرج الرئة خلال الرئة نضح28،29، 30-على الرغم من كون كفسي تعقب خلية طويل الأجل، كثافة الأسفار النصف كل انقسام الخلية27، تحد من استخدامها بوصفها تقنيات طاقة. للتحايل على هذه المشكلة، ينبغي أن يتأكد أن جرعة كفسي التوسيم كاف للخلايا لتظل قابلة للكشف لكامل مدة في فيفو والتجارب وأن أي معاملة المطبق على خلايا ليس له أي تأثير على الخلية الانتشار. لأنه تم القيام بالمقارنة والقياس الكمي لاستعمار الرئة شسكر وريادية شفن في الفئران منفصلة، يمكن القول بأن الاختلافات بين المجموعتين كانت سبب الاختلاف الفردية. لاستبعاد مثل هذه التباينات، خليط نوعين من ورم الخلايا المسماة مع متميزة فلوريسسي الأصباغ (مثلاً، كفسي/سم-دي) أو ستابلي transfected مع بروتينات فلورية خضراء/دسريد قد تكون في الوقت ذاته عن طريق الوريد حقن الحيوان نفسه في استعمار الرئة الاعتداء31،،من3233. تجدر الإشارة إلى أن الاستنساخ الآثار الناجمة عن الخلية الاستنساخ التكنولوجيا التي تتم محاولة لفرز ستابلي نيون الخلية transfected البروتين استنساخ مع الأسفار قوية بما فيه الكفاية34،35، 36 , 37 -يجوز الخلايا المستنسخة تمثيلي لتمثيل مجموعات كاملة من السكان غير متجانسة38،39،40. إذا كان هو المطلوب من تعداء مستقرة لأي بروتين فلوري في الخلايا السرطانية لفحوصات الاستعمار الرئة، رفع كفاءة تعداء الخلايا السرطانية ككل ينبغي أن أفضل الحفاظ على الخصائص الأصلية من استنساخ الخلية السكان مع41،fluorescence كافية42.

خطوات نضح الرئة في استعمار الرئة فحوصات ضرورية حيث أن بعض الخلايا السرطانية حقن الوريد، بدلاً من إلقاء القبض على وجه التحديد إلى نظام شعري الرئة، تميل إلى أن يكون ميكانيكيا المحاصرين والتشويش داخل الشبكات الشعرية للرئة الأنسجة بسبب أقطار المتوسط أكبر من ريادية من عرض الرئة لومن الشعرية43،44. قد تؤدي المبالغة في التقدير الكمي للخلايا السرطانية استعمار الرئة دون بيرفوسينج الرئتين بالخطأ عد46،45،الخلايا ميكانيكيا التشويش47. وحتى إذا كان قد تم perfused الرئتين، تظل هناك مشاكل إضافية. على سبيل المثال، لا يزال من الصعب التفريق بين ما إذا كانت الخلايا السرطانية استعمار الرئة الموجودة على الجهاز لومينال، أو يكون الفعل اكسترافاساتيد من الأوعية الدموية. لحل هذه المشكلة، تلطيخ الأوعية الدموية مع مترافق والرودامين ديكستران كالمشار إليها أعلاه قد تكون مفيدة30،،من4849. بدلاً من ذلك، إذا كان المطلوب هو التحديد الكمي للتسرب الورم، الكالسيوم-chelator يدتا/عطا أو التربسين، حوزتي غير محددة، يمكن استخدامها في المخزن المؤقت لنضح تعوق تعتمد على الكالسيوم-والمستقلة ورم خلية التصاق أحداث50 , 51 , 52-وهكذا، قد تعتبر الخلايا السرطانية المتبقية في أنسجة الرئة كما اكسترافاساتيد.

للتحديد الكمي للخلايا السرطانية استعمار الرئة، الرئتين perfused كثيرا ما تتعرض للفحص المجهري [كنفوكل] التقليدية. ومع ذلك، محدودة إمكانية قياس عمق النسيج يرجع جزئيا إلى أوتوفلوريسسينسي الأنسجة والأسفار نثر الآثار، تقديم أعمق أنسجة غير قابلة للكشف53،54. مجهر فوتون اثنين مع حساسية أعلى من مجهر تقليدية [كنفوكل] مناسبة لحل مثل هذه المشاكل في هذا الإشعاع بالقرب من الأشعة تحت الحمراء المستخدمة في الإثارة اثنين-فوتون مع امتصاص أقل بكثير من العينات البيولوجية من الأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأخضر والأزرق يجعل هذا الأسلوب أكثر ملاءمة لتصوير العينات سميكة55،،من5657. ورم خلايا الرئة استعمار تحسب بحساب متوسط أرقام خلية الورم في عدة صور الممثل [كنفوكل]، التي لا تشمل عدد كامل من استعمار الرئة الخلايا السرطانية في الرئتين كل حيوان فردية. لتحديد حجم الرئتين كلها في فحوصات الاستعمار الرئة، يمكن استخدام الخلايا السرطانية ستابلي transfected مع لوسيفراس والرئتين perfused ثم يمكن أن تخضع للتصوير بعد التطعيم عن طريق الحقن الوريدي من الخلايا السرطانية تعليق حضور إيفيس لوسيفرين46،،من5859. وبدلاً من ذلك، يمكن أن مفروم إلى قطع الرئتين perfused ويتعرض الهضم الأنزيمي مع البروتياز، مثلاً، كولاجيناز، الإفراج عن الخلايا المفردة في تعليق60،61. الورم الخلايا مع الأصباغ الفلورية أو ستابلي transfected مع الأسفار ثم يمكن تحديدها كمياً من البروتينات مع خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) تحليل56،62.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب أود أن أشكر الدكتور تشانغ مينغ-مين والسيدة تشنغ هسين-يا لتقديم الدعم التقني لهم. هذا العمل كان تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان (معظم-103-2325-ب-006-009، ومعظم-104-2325-ب-006-001، معظم-105-2325-ب-006-001، و MOST-106-2320-B-006-068-MY3) ووزارة الصحة والرعاية الاجتماعية (MOHW106-TDU-ب-211-144004). نحن ممتنون أيضا للدعم من "مختبر البحوث الأساسية" لكلية الطب، جامعة تشينغ كونغ الوطنية، مجهر [كنفوكل] فوتون متعددة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Bovine Serum Albumin (BSA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-9048-46-8
Bouin's Fluid MCC(medical chemical corporation)/POISON 456-A-1GL
CFSE Proliferation Dye ebiosciences 65-0850-85 Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)  (Gibco)ThermoFisher Scientific 12100-061
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-6381-92-6 For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) 
Fetal bovine serum (FBS) (Gibco)ThermoFisher Scientific 10437-028
Lewis lung carcinoma (LLC) ATCC, Manassas, VA, USA CRL-1642
L-Glutamine, USP  (Gibco)ThermoFisher Scientific 21051-024
Potassium chloride (KCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7447-40-7 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM )
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7778-77-0 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM )
Sodium chloride (NaCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7647-14-5 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM )
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-10039-32-4 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM )
Trypan Blue Sigma Aldrich T6146 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS
Trypsin Sigma Aldrich T4799 For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L )
Zoletil 50 Virbac To dilute with 1X PBS 
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Compact Tabletop Centrifuge 2420 KUBOTA Co. 2420
Culture dish (6cm) Wuxi NEST Biotechnology Co. 705001
Disposable syringe (with needle) Perfect Medical Industry Co. 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml
End over end mixer C.T.I YOUNG CHENN TS-20 For suspended cells recovery 
FACSCalibur (FACS) BD biosciences
Forceps Dimeda 10.102.14
Forma Direct Heat CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Inc. HEPA CLASS 100
Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) Stoelting 51338
Multiphoton Confocal Microscope BX61WI Olympus FV1000MPE
Neubauer counting chamber Marienfeld-Superior 640010
Surgical scissor Dimeda 08.370.11
Surgical sutures  UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. NO. 0034 Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0)
1.5 mL microcentrifuge tube Wuxi NEST Biotechnology Co. 615001
15 mL Greiner tube Greiner bio-one 188271

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
  2. Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
  3. Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells - mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
  4. Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  5. Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
  6. Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
  7. Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  8. Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
  9. Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
  10. Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
  11. Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
  12. Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
  13. van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
  14. Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
  15. Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
  16. von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
  17. Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
  18. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
  19. Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
  20. Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
  21. Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
  22. Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
  23. Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
  24. Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
  25. Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
  26. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  27. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  28. Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
  29. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  30. Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
  31. Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
  32. Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
  33. Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
  34. Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
  35. Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
  36. Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
  37. Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  38. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  39. Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
  40. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  41. Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
  42. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  43. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  44. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  45. Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
  46. Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
  47. Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
  48. Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
  49. Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
  50. Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
  51. Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
  52. Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
  53. Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
  54. Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
  55. Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
  56. Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
  57. Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
  58. Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
  59. Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
  60. Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
  61. Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
  62. Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 136، ورم خبيث، فحوصات الاستعمار الرئة، نضح الرئة، تعميم الخلايا السرطانية، إستر سوكسينيميديل كاربوكسيفلوريسسين، فيبرونيكتين البوليمرية، والتسرب
إنشاء مقايسة الاستعمار الرئة لتعميم التصور خلية الورم في أنسجة الرئة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, T. C., Liao, Y. C., Chang, W.… More

Lin, T. C., Liao, Y. C., Chang, W. T., Yang, C. H., Cheng, L. H., Cheng, M., Cheng, H. C. The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues. J. Vis. Exp. (136), e56761, doi:10.3791/56761 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter