Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Summary

Biz bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları ve Ca^{2 +} geçişler akut beyin dilimleri içinde nöronal dendrites kaydetmek için iki fotonlu Imaging birleştiren bir yöntem mevcut.

Abstract

Kalsiyum (Ca^{2 +}) görüntüleme intrasellüler Ca^{2 +} sinyaller nöronal dendrites de kronolojik zamanmekansal dinamikleri araştırmak için güçlü bir araçtır. CA^{2 +} dalgalanmaları membran ve hücre içi mekanizmaları çeşitli aracılığıyla ortaya ve sinaptik plastisite indüksiyon ve dendritik uyarılabilirlik düzenlenmesi önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, farklı tipteki Ca^{2 +} sinyalleri dendritik dallarında kaydetmek için yetenek nasıl dendrites bilgi entegre eğitim grupları için değerlidir. İki fotonlu mikroskobu gelişiyle böyle çalışmaları önemli ölçüde canlı doku, ışık saçılma ve duyarlilik gibi görüntüleme için içsel sorunları çözerek kolaylaştırdı. Ayrıca, geleneksel Elektrofizyolojik teknikleri ile görüntüleme İki fotonlu Ca^{2 +} arada yoluyla, yerel Ca^{2 +} dalgalanmalar nöronal dendrites kayıtları ile paralel olarak sinaptik faaliyete araştırmak mümkün olduğunu Soma. Burada, GABAergic inhibitör interneurons dendrites içinde yerel Ca^{2 +} geçişler (kediler) dinamiklerini incelemek için bu yöntemi kullanmak nasıl açıklar. Yöntem aynı zamanda akut beyin dilimleri farklı nöronal türleri içinde sinyal dendritik Ca^{2 +} eğitim için uygulanır.

Introduction

Ağ etkinliği için bir neuron katkısı büyük ölçüde aldığı sinaptik girişleri dinamik yapısı tarafından belirlenir. Geleneksel olarak, nöronlar sinirsel aktivite karakterize baskın yöntemi somatik hücre içi bütün yama-kelepçe kayıtların postsinaptik akıntılarının aksonlar geçiş elektriksel stimülasyon tarafından uyarılmış dayanıyordu. Ancak, proksimale yer sinapslarda tek faaliyet truthfully bu durum¹‘ bildirdi. Buna ek olarak, sinaps özgü mekanizmaları değerlendirmek için kayıtları çiftinden nöronların ve dendrites belirli bir konumda sinapslarda ilgi ve dendritik Tümleştirme, mekanizmaları sırasıyla hedeflemek için kullanılmaktadır. Sinaptik fizyolojisi alanında büyük bir atılım optik ve Elektrofizyolojik teknikleri bir evlilik yoluyla elde edildi. Ca^{2 +} görüntüleme ve optogenetic araçları ile birlikte mikroskobu (2PLSM) tarama iki fotonlu uyarma lazer beyin dilim belirli nöronal Connections sinirsel aktivite dinamik organizasyon muazzam ayrıntıları açığa in vitro ve in vivo.

Birkaç önemli avantajlar yapılan geleneksel, bir foton uyarma mikroskobu²den öne 2PLSM: (1) İki fotonlu uyarma doğrusal olmayan doğası nedeniyle, Floresans sadece odak biriminde oluşturulur ve tüm verilmiş fotonlar temsil yararlı sinyalleri (iğne deliği için gerek yoktur); (2) daha uzun dalga boylarında, 2PLSM içinde kullanılan saçılma doku daha verimli bir şekilde nüfuz; Buna ek olarak, dağınık fotonlar İki fotonlu uyarma ve arka plan Floresans üretmek için çok seyreltik; (3) odak düzlemi duyarlilik ve fototoksisite sınırlıdır. Bu nedenle, 2-Foton sistemleri ile karşılaştırıldığında geleneksel confocal mikroskoplar yüksek maliyet rağmen 2PLSM yönteminin seçimi nöronal yapıyı ve kalın canlı dokuya işlevinde yüksek çözünürlüklü incelenmesi için kalır.

Yapısı ve fonksiyonu dendritik dikenleri³görüntüye saçılma doku 2PLSM ilk uygulama oldu. 2PLSM Ca^{2 +} görüntüleme ile birlikte bu dikenleri fonksiyonu izole biyokimyasal bölmeleri ortaya koymuştur. Beri birçok nöronal türlerinde dikenleri ve bireysel sinapslarda⁴arasında bire bir ilişkiyi, yakında Imaging İki fotonlu Ca^{2 +} oldu, sağlam doku^{5bireysel sinapslarda Etkinlik bildirimi yararlı bir araç 6,7,8}. Ayrıca, 2PLSM tabanlı Ca^{2 +} görüntüleme başarıyla tek kalsiyum kanalları ve içsel ve sinaptik conductances arasındaki doğrusal olmayan etkileşimleri etkinliğini izlemek için hem de devlet ve etkinlik bağımlı değerlendirmek için kullanıldı düzenleme, nöronal dendrites^{5,6,7,8,9,10,11}‘ sinyal Ca^{2 +} .

Kalsiyum olduğu her yerde birden bulunan hücre içi ikinci haberci ve hücre altı kronolojik zamanmekansal kuruluşu değişikliği iyon düzenlenmesi için sinaptik gücü’nden fizyolojik tepkiler yönünü belirler kanalları, büyüme, dendrite ve omurga olarak hücre ölümü ve hayatta kalma iyi. Dendritik Ca^{2 +} yükselmeler birden çok yolları aktivasyonu ile oluşur. Aksiyon potansiyelleri (APs), backpropagating dendrites için voltaj kalsiyum kanal¹² açık ve nispeten genel Ca^{2 +} geçişler (kedi) dendrites ve dikenleri¹³‘ te üretmek. Sinaptik iletimi postsinaptik Ca^{2 +}harekete geçirmek ile ilişkili-geçirgen reseptörleri (NMDA, Ca^{2 +}-geçirgen AMPA ve kainate), sinaptik tetikleme CaTs^6,14,15. Son olarak, belirli koşullar^11,12,13,16altında dendrites supralinear Ca^{2 +} olaylar oluşturulabilir.

İki fotonlu Ca^{2 +} görüntüleme yama-kelepçe Elektrofizyolojik kayıtlar ile birlikte istihdam sentetik Ca^{2 +}-yama elektrot ile bütün hücreli kayıtları sırasında genellikle teslim hassas floresan göstergeleri . Miktar Ca^{2 +} dinamiği için standart bir yol üzerinde ikili gösterge yöntemi^17,18temel alır. İki fluorophores de ayrılmış emisyon spectra ile kullanır (örneğin, birleşiminden oluşan bir kırmızı Ca^{2 +}-duyarsız boya ile yeşil Ca^{2 +} göstergeleri, Oregon yeşil BAPTA-1 veya Fluo-4 gibi) ve zaman göre birçok avantajı vardır Tek göstergesi yöntemi. Önce bir Ca^{2 +}-büyük küçük harf duyarlı boya küçük yapılar ilgi (dendritik şube ve dikenleri) Ca^{2 +} görüntüleme yapılacağı yeri bulmak için kullanılır. İkinci olarak, yeşil ve kırmızı Floresans (ΔG/R) değişikliği arasındaki oran, [Ca^{2 +}], [Ca^{2 +}]₀¹⁷ dalgalanmalar nedeniyle temel Floresans değişimler büyük ölçüde duyarsız olan ölçütü olarak hesaplanır ^{, 18}. Ayrıca, Floresans değişiklikleri^{mutlak Ca 2 +} konsantrasyonları¹⁹açısından kalibre edilmesi.

İki fotonlu Ca^{2 +} görüntüleme deneyler akut dilimler halinde çalışırken bir genel resim alma genellikle kullanılan yüksek lazer gücü nedeniyle kararlılığını ve hücre sağlık husustur. Ayrıca, Ca^{2 +} görüntüleme deneyler, işte pertürbasyon ve önemli tahmindi hücre altı Ca^{2 +} dinamikleri hakkında endişe gerçeğini Ca^{2 +} göstergeleri son derece mobil eksojen Ca^{2 +} hareket nedeniyle arabellekleri. Bu nedenle, Ca^{2 +} göstergesi ve onun konsantrasyonu seçimi nöronal türü, kediler beklenen genliği ve deneysel soru bağlıdır.

Biz iki fotonlu Ca^{2 +} görüntüleme yöntemi Ca^{2 +} dalgalanmalar dendrites GABAergic interneurons^{9,10,11,20,21} incelenmesi için uyarlanmış ^{, 22}. asıl nöronlarda erken Ca^{2 +} görüntüleme çalışmaları toplu bitmiş ise inhibitör interneurons alanındaki bu piramit hücreleri²⁰ farklı olan fonksiyonel Ca^{2 +} mekanizmaları çeşitli vitrin ^{, 23 , 24}. bu interneuron özgü mekanizmaları (örneğin, Ca^{2 +} geçirgen AMPA reseptör) hücre etkinlik düzenlenmesinde belirli rol oynayabilir. İnterneurons içinde sinyal dendritik Ca^{2 +} daha fazla araştırma yapılması için cazip bir hedef olmakla birlikte, bu hücreler dendrites içinde görüntüleme İki fotonlu Ca^{2 +} dendrites daha ince çapı ve dikenleri için eksikliği ek sorunlar sunar özellikle yüksek endojen Ca^{2 +} Bağlama kapasitesi. Hipokampal interneurons çalışmanın odak araştırma ilgi gibi aşağıdaki iletişim kuralı geçerli olsa da farklı nöron popülasyonları, bu sorunlarla başa çıkmak için uyarlanmıştır.

Bu iletişim kuralı ile iki dış, Sigara descanned dedektörleri (NDDs), elektro-optik modülatör (EOM) ve degrade kontrast (SGC) tarama bir Dodt ile donatılmış ve optik bir tablo üzerinde yüklü bir ticari confocal İki fotonlu mikroskop, idam edildi. Mikroskop Ti:Sapphire multiphoton lazer modu kilitli-800 ile birleştiğinde nm (> 3 W, 140 fs bakliyat, 80 Hz tekrarlama oranı). Görüntüleme sistemi ile sıcaklık kontrolü, iki micromanipulators ile çeviri bir platform, bilgisayar kontrollü elektrot amplifikatör, bir çizim tablası, bir uyarı bir perfüzyon odası dahil olmak üzere bir standart Elektrofizyoloji teçhizat ile donatılmıştır birimi ve veri toplama yazılımı.

Protocol

Tüm deneyler Université Laval, Hayvan Koruma Komitesi ve hayvan bakımı Kanada Konseyi ve hayvan refahı kuralları uyarınca gerçekleştirilmiştir. 1. ön hazırlık (isteğe bağlı: 1 gün önceden hazırlamak) Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözüm (Normal, sukroz ve kurtarma çözümleri, 1 L; bkz: Tablo 1) üç tür hazırlamak. 300 ± 10 mOsm25 çözümlerinize osmolalite ayarlamak ve ACSF-Sükroz yakınındaki-donma noktas…

Representative Results

Burada sunulan iletişim kuralını kullanarak, somatik geçerli enjeksiyon ve Hipokampus CA1 alanında oriens/alveus interneurons dendrites içinde elektrik stimülasyonu tarafından uyarılmış CaTs elde edilen. Sonra belirlenen bir nöron, yama, şekil ve konumunu temel alarak, biz linescans proksimal dendrite birden çok noktalarda karşısında alınan verilen mesafeler soma (şekil 1A). Soma (azaltılmış AP genlik veya kalsiyum kanal dağıtım, <str…

Discussion

Burada gösterilen yöntem nöronal dendrites akut beyin dilimleri içinde sinyal dendritik Ca^{2 +} eğitimi için iki fotonlu Ca^{2 +} görüntüleme ve yama-kelepçe Elektrofizyoloji ile birlikte nasıl kullanılacağını gösterir. Bu yöntem dendritik kesimleri ve somatik hücrenin tepkisinde elektrik stimülasyon veya backpropagating AP tarafından uyarılmış her iki yerel Ca^{2 +} çizimleri izlenmesi için izin verir. Bu çalışma dendritik ağacının nasıl çeşitli yerlerinde giri?…

Materials

Animal Strain: Mouse CD1	Charles River	022
Isoflurane	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 hydrochloride	Abcam	ab120337
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldehyde powder, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium gluconate	Sigma-Aldrich	P1847
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253
Sodium phosphate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71643
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Adenosine triphosphate (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosine (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937
Streptavidin-conjugated Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Borosilicate Glass Capillaries	Sutter Instrument	BT-150-10
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instrument
TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser	Coherent
LAS AF Imaging Acquisition Software	Leica Microsystems
Temperature Controller TC-324B	Warner Instruments
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Translator	Siskiyou
Micromanipulator	Siskiyou
pClamp Data Acquisition Software	Molecular Devices
A365 Constant Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems