소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

Summary

여기, 선물이 murine NK 세포 유전자 침묵 시키기 기계 연구 생체 외 및 생체 내에서피더 무료 차별화 시스템을 사용 하 여 대량 생산 하는 프로토콜.

Abstract

자연적인 살인자 (NK) 세포는 타고 난 면역 계통에 속해 있으며 첫 번째 라인 항 암 면역 방어; 그러나, 그들은 종양 microenvironment에서 억제 되 고 기본 메커니즘은 아직 크게 알려진. NK 세포의 일관 되 고 신뢰할 수 있는 소스의 부족 NK 세포 면역의 연구 진행을 제한합니다. 여기, 우리가 시험관에서 시스템 높은 품질과 급지대 무료 조건 murine NK 세포 골 수 유래의 수량을 제공할 수 있는 보고 합니다. 더 중요 한 것은, 우리는 또한 그 중재 하는 siRNA 유전자 침묵이 시스템을 사용 하 여 E4bp4 종속 NK 세포 성숙 억제 성공적으로 보여 줍니다. 따라서,이 소설 체 외에서 NK 세포 분화 시스템 면역 연구를 위한 소재 솔루션입니다.

Introduction

암 진행은 종양 microenvironment^1,2, 호스트에서 파생 된 immunocytes, 예를 들면, NK 세포에 크게 의존 합니다. 여러 학문의 intratumoral NK 세포는 종양 진행^3,4부정적인 상관 관계를 설명 했다. 또한, 임상 연구 보여주었다 NK 세포 입양 치료 암^5,6,7,,89에 대 한 가능한 전략 이다. NK 세포 기반 암 immunotherapy 최근 단단한 종양을 위한 치료 선택권으로 제안 되었다 하지만 면역 억제 cytokines의 분 비와 고체 종양 ^{의 microenvironment에 ligands 활성화 downregulation 존재 하는 과제 10,11}. 변형 시키는 성장 인자-β (TGF-β) 발암에 진압 역할을 제안 하고있다 하지만 역설적으로 암 세포는 또한 TGF-β1 종양 개발^12,,1314 를 지원 하기 위해 생산 ^{, 15}. 인터페론 응답 다운 규제 및 CD16-중재 인터페론-감마 (IFN-γ) 생산 체 외에서^{16,17를 통해 NK 세포의 cytolytic 활동을 억제 수 있습니다 TGF-β 신호 18}.

TGF-β 신호 종양 microenvironment에의 중단 될 수 있지만 암 제거 가능한 방법, 완전히 TGF-β 신호를 차단 하면 항 염증 기능을 인해 자가 면역 질환의 개발에 의해 입증 부작용 등 조직의 염증, 심장 결함, 그리고 마우스에 면역¹⁹모델. 따라서, TGF-β-중재 면역 억제의 작동 메커니즘을 이해 이어질 것입니다 암 치료에 대 한 접근 치료 대상의 식별.

NK 세포 개발에 필요한 분자 이벤트 명료 하 윌리엄스 외 ²⁰세포 NK로 murine 골 수 조 혈 줄기 세포 분화에 대 한 생체 외에서 시스템 설립. 이 시스템은 크게 NK 세포²¹의 소설 창시자의 식별을 포함 하 여 NK 세포 개발의 기계 론 적인 연구를 촉진 한다. 그러나, 골 수 창시자로 피더 레이어^20,21, OP9 stromal 세포를 지 원하는 시스템에서 경작 한다 그리고이 다른 유형의 세포 인구는 주로 유전자 방해의 추가 응용 프로그램 제한 도구 (예를 들어, 중재 하는 siRNA 유전자 침묵) 차별화 NK 세포에 구체적으로 적용.

여기, 우리 더 윌리엄스 외²⁰의 생체 외에서 시스템을 수정 하 여 개발 된 피더 무료 시스템을 설명 합니다. 우리의 시스템에 OP9 stromal 피더 세포는 필요 하 고 대신 조건부 매체 최근 NK 세포에 생체 외에서그리고이의 차별화를 영향을 주지 않고 사용 OP9 TGF-β는 암 진행을 통해 홍보할 수 밝히기 위해서 우리를 끌 종양 microenvironment²²에 E4bp4 종속 NK 세포 개발 억제 이 새로운 시스템 성공적으로 elucidating 특정 조건 하에서 NK 세포 개발의 분자 메커니즘에 대 한 배경 없는 메서드를 제공 합니다 (예를 들어, 높은 TGF-β1, 중재 하는 siRNA 유전자 침묵, 등.) 생체 외에서.

Protocol

프로토콜 및 골 수 유래 NK 분화 세포 (BM-NK)에 대 한 이전 게시 방법20,,2122에 기반. 쥐와 모든 절차는 여는 동물 윤리 실험 위원회 (AEEC) 홍콩의 중국 대학에 승인 되었습니다. 1입니다. 준비 OP9 조건부 매체의 알파-MEM 20 S, 100 U/mL 페니실린 G 및 공기/CO2 의 습도 분위기에서 37 ° C에서 100 µ g/mL …

Representative Results

대표 결과 설명된 프로토콜에 따라 얻을 수 있습니다. 총 골 현 탁 액 셀 피더 무료 차별화 시스템에서 11 일; 재배 했다 확산 속도에 상당한 증가 하루 7 일 0 (그림 1A)에 총 셀 개수와 비교 하 여 관찰 되었다. 높은 세포질에 핵 비율 및과 립 풍부한 세포질 형태학 NK 세포로 성숙 시스템 (그림 1B)에서 6 일?…

Discussion

현재 작업에서 우리는 murine NK 세포 골 수 파생 에 시험관을 생산 하는 새로운 방법을 설명 했습니다. 원래 시스템^21,22 에 셀 피더 성공적으로 크게 차별화 시스템의 안정성을 증가 OP9 셀의 조건부 매체에 의해 대체 됩니다. 또한, 시스템 높은 수량을 생산할 수 있는 고 순도 성숙한 NK의 세포 생체 외에서 뿐 아니라 대 한 vivo에서 분석 …

Materials

OP9 cell line	ATCC	ATCC® CRL-2749™
MEM α, no nucleosides	Gibco	22561021
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Recombinant Murine IL-7	PEPROTECH	217-17
Recombinant Murine SCF	PEPROTECH	250-03
Recombinant Murine Flt3-Ligand	PEPROTECH	250-31L
Recombinant Murine IL-2	PEPROTECH	212-12
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	1377815
IC Fixation Buffer	eBioscience	00-8222-49
Flow Cytometry Staining Buffer	eBioscience	00-4222-26
PE-conjugated anti-mouse CD244	eBioscience	12-2441-83
Cy3-conjugated anti-mouse NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
Nonsense control (NC)	Ribobio	siN05815122147
siRNA against mouse E4BP4 mRNA	Ribobio	N/A	5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′