Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Gen-silencing murine NK-Zellen durch ein Feeder-freie Unterscheidung System für mechanistischen Studie in Vitro und in Vivoin Serienfertigung herzustellen.
Abstract
Natürliche killer (NK) Zellen des angeborenen Immunsystems gehören und sind eine Erstlinien Anti-Krebs-Immunabwehr; aber sie werden in den Tumor Mikroumgebung unterdrückt und der zugrunde liegende Mechanismus ist noch weitgehend unbekannt. Das Fehlen einer einheitlichen und zuverlässigen Quelle von NK-Zellen begrenzt den Forschungsfortschritt NK Zelle Immunität. Hier berichten wir über eine in-vitro- System, die hohe Qualität und Quantität der Knochenmark-abgeleitete murinen NK-Zellen unter einem Feeder-freie Zustand zur Verfügung stellen kann. Noch wichtiger ist, zeigen wir auch, dass SiRNA-vermittelten Gen-silencing erfolgreich die E4bp4-abhängige NK Zelle Reifung hemmt durch den Einsatz dieses Systems. Somit ist diese neuartige in-vitro- NK-Zelle Unterscheidung System eine Biomaterial-Lösung für Immunitäts-Forschung.
Introduction
Tumorprogression ist weitgehend abhängig von den Tumor Mikroumgebung1,2, einschließlich Host abgeleitet Immunzellen, z.B., NK-Zellen. Mehrere Studien gezeigt, dass die intratumorale NK-Zellen mit dem Tumor Progression3,4negativ korreliert sind. Klinische Studien zeigten darüber hinaus, dass NK-Zell-Adoptiv-Therapie eine mögliche Strategie für Krebs5,6,7,8,9 ist. NK-Zell-basierte Krebs-Immuntherapie wurde vor kurzem als eine Therapieoption bei soliden Tumoren vorgeschlagen, aber Herausforderungen gibt es durch die Sekretion von immunsuppressive Zytokine und Downregulation Liganden in der Mikroumgebung von soliden Tumoren zu aktivieren 10,11. Umwandlung Wachstumsfaktor-β (TGF-β) ist eine suppressive Rolle in der Karzinogenese vorgeschlagen worden, aber paradoxerweise Krebszellen produzieren auch TGF-β1 zur Unterstützung der Tumor Entwicklung12,13,14 , 15. TGF-β-Signalisierung kann die zytolytischen Aktivität von NK-Zellen über Down-Regulierung Interferon Reaktionsfähigkeit und CD16-vermittelten Interferon-Gamma (IFN-γ) Produktion in-vitro-16,17, unterdrücken 18.
Obwohl Störungen von TGF-β-Signalisierung in der Mikroumgebung Tumor eine Möglichkeit zur Beseitigung von Krebs sein kann, wird vollständige Sperrung der TGF-β-Signalisierung Autoimmunerkrankungen durch seine entzündungshemmende Funktion dazu führen, dass ausweislich der Entwicklung Nebenwirkungen einschließlich systemische Entzündung, modelliert Herz-Kreislauf-Mängel und Autoimmunität in Maus19. So wird Verständnis der Arbeitsmechanismus der TGF-β-vermittelten Immunsuppression zur Identifizierung einer zugänglichen therapeutisches Ziel für die Behandlung von Krebs führen.
Um die molekularen Ereignisse notwendig für NK-Zell-Entwicklung zu erhellen, gegründet Williams Et Al. eine in Vitro -System Differenzierung murinen Knochenmark hämatopoetischen Stammzellen in NK20Zellen. Dieses System erleichtert vor allem die mechanistische Untersuchung der NK-Zell-Entwicklung, einschließlich der Ermittlung der neuartigen Stammväter von NK-Zellen-21. Jedoch Knochenmark Stammväter sollten im System mit OP9 Stromazellen Stützzellen als ein Feeder Schicht20,21kultiviert werden, und diese heterogene Zellpopulation weitgehend beschränkt die weitere Anwendung der gen-Störung Werkzeuge (z.B., SiRNA-vermittelten Gen-silencing) speziell auf die differenzierenden NK-Zellen angewendet.
Hier beschreiben wir ein Feeder-freie System, das durch eine weitere Änderung der in-vitro- System von Williams Et Al20entwickelt wurde. In unserem System der OP9 Stromazellen Feeder-Zellen sind nicht erforderlich, und stattdessen OP9 bedingte Medium verwendet wird, ohne Auswirkungen auf die Differenzierung der NK Zellen in Vitro, und dies vor kurzem führen uns zu entdecken, dass TGF-β Tumorprogression über fördern kann E4bp4-abhängige NK-Zell-Entwicklung in den Tumor Mikroumgebung22zu unterdrücken. Dieses neuartige System bietet erfolgreich eine Hintergrund-freie Methode für die Aufklärung des molekularen Mechanismus der NK-Zell-Entwicklung unter bestimmten Bedingungen (z.B.hohe TGF-β1, SiRNA-vermittelten Gen-silencing, etc..) in Vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der vorliegenden Arbeit haben wir eine neuartige Methode zur Herstellung von Knochenmark stammenden murinen NK Zellen in Vitrobeschrieben. Die Zelle Zuführung in das ursprüngliche System21,22 wird erfolgreich durch das Medium bedingte OP9 Zellen, die weitgehend die Stabilität des Systems der Differenzierung erhöht ersetzt. Darüber hinaus kann das System hohen Menge produzieren und Reinheit der Reife NK Zellen in Vitro als auch in Viv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde unterstützt durch die Research Grants Council of Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) und der Innovation und Technology Fund of Hong Kong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), direkte Finanzhilfe für Forschung-CUHK (2016.035) und Hong Kong Gelehrter Programm.
H.-YL konzipiert und betreut alle Experimente und trugen zum Manuskript Vorbereitung. Uhr-k.t. Experimente durchgeführt, analysiert Daten und trugen zum Manuskript Vorbereitung. P.C.-T. T., D.S.-F.C., j.s.-C., H., f.-M.W., und G.-YL tierische Proben gesammelt und im Tierversuch teilgenommen. J.s., X.-R.H. und K.-f.t. zum Manuskript Vorbereitung beigetragen.
Materials
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
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