الأيضي رسم الخرائط ذات الصلة: سيتوتشيميستري كمية إنزيم وهيستوتشيميستري لتحديد نشاط ديهيدروجيناسيس في الخلايا والأنسجة

Summary

نقدم هنا، بروتوكول التي يمكن استخدامها لتصور مجهريا وتحديد حجم النشاط ديهيدروجيناسيس في الخلايا والأنسجة والحركية، ووظيفتها والتعريب سوبسيلولار.

Abstract

تغيير الأيض الخلوية سمة مميزة للكثير من الأمراض، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والإصابة. الوحدات الحركية الأيضية للخلايا الإنزيمات وينظم نشاطهم بشكل كبير على العديد من المستويات، بما في ذلك النسخي، الاستقرار مرناً، ومستوى متعدية الجنسيات وبوستترانسلاشونال والوظيفية. يعني هذا النظام المعقد أن فحوصات الكمية أو التصوير التقليدي، مثل كمية مرناً التجارب و “اسطوانات يقوم الغربية” وإيمونوهيستوتشيميستري، تسفر عن معلومات غير مكتملة فيما يتعلق بهذا النشاط في نهاية المطاف من الإنزيمات، وظيفتها و/أو تعريب سوبسيلولار بهم. كمية الإنزيم سيتوتشيميستري وهيستوتشيميستري (أي، تعيين الأيضية) إظهار معلومات متعمقة في النشاط الأنزيمي في الموقع وحركية، ووظيفتها والتعريب سوبسيلولار في حالة شبه الحقيقي للطبيعة.

يصف لنا وضع بروتوكول للكشف عن نشاط ديهيدروجيناسيس، وهي الإنزيمات التي تقوم بتفاعلات الأكسدة والاختزال للحد من العوامل المساعدة مثل NAD(P)⁺ وبدعة. أقسام الأنسجة والخلايا هي المحتضنة في متوسط التي محددة للنشاط الأنزيمي من نازعة واحد. في وقت لاحق، ينفذ نازعة الذي يخضع للتحقيق النشاط الأنزيمي في موقعها سوبسيلولار. في تفاعل كيميائي مع المتوسط رد فعل، ينشئ هذا في نهاية المطاف formazan زرقاء اللون في موقع النشاط نازعة. ولذلك امتصاص فورمازان مقياسا مباشرا للنشاط نازعة ويمكن قياسها كمياً باستخدام تحليل الفحص المجهري وصورة الضوء أحادي اللون. الجانب الكمي لهذا البروتوكول يتيح للباحثين ﻻستخﻻص النتائج الإحصائية من هذه الاختبارات.

بالإضافة إلى دراسات قائمة على الملاحظة، يمكن استخدام هذا الأسلوب للدراسات تثبيط إنزيمات معينة. وفي هذا السياق، دراسات تستفيد من مزايا حقيقية لطبيعة التعيين الأيضية، قد يكون إعطاء النتائج في الموقع أن فسيولوجيا ذات الصلة أكثر مما في المختبر الدراسات تثبيط إنزيم. في كل شيء، تعيين الأيضية أسلوباً لا غنى عنه لدراسة التمثيل الغذائي على المستوى الخلوي أو الأنسجة. من السهل أن تعتمد التقنية ويوفر معلومات متعمقة وشاملة ومتكاملة الأيضية ويتيح التحليل الكمي السريع.

Introduction

ركنا أساسيا في الفيزيولوجيا الخلوية هو التمثيل الغذائي. الأيض يوفر الخلايا بالطاقة اللازمة لجميع العمليات الفسيولوجية ويسلم اللبنات الأساسية للتركيب الحيوي الجزيئات، وينظم التوازن الخلوية فيما يتعلق بمنتجات النفايات وجزيئات سامة والتفكيك و إعادة تدوير مكونات الخلوية معطلة أو غير الضرورية. تحفيز ما يقرب من جميع التفاعلات الكيميائية الخلوية الحيوية الإنزيمات وبالتالي هي الوحدات الحركية في فسيولوجيا الخلايا. ^{1 , 2}

أحكام تنظم نشاط الإنزيمات على مستويات عديدة وذلك كمية الإنزيم هيستوتشيميستري وسيتوتشيميستري (وتسمى أيضا تعيين الأيضية) هو الأسلوب المفضل لدراسة نشاط إنزيم في الموقع. أما على المستوى النسخي، هو تنظيم التعبير الجيني في مرناً. ويمكن تحديد أثر تنظيم النسخ استخدام الكمية فحوصات مرناً، مثل [ميكروارس] أو تسلسل الحمض النووي الريبي مباشرة، أو فحوصات مرناً النوعية، مثل التهجين في الموقع الذي يعطي معلومات عن الخلوية (الفرعية) ترجمة جزيئات مرناً. وهذا يجعل من الممكن أن نقدر الفروق النسبية في النشاط الترانسكربتي بين الخلايا. ومع ذلك، معقد التفسير وصحة هذه فحوصات مرناً فيما يتعلق بالنشاط الأيضي للتنظيم يحدث أيضا على مستوى مرناً، حيث تسلسل واستقرار الجزيئات مرناً يتم تحريرها بعد ذلك يتم نسخها من الحمض النووي. وينظم هذا التحرير ترجمة isoform البروتين وكمية البروتين الترجمة في ريبوسوم. وبالإضافة إلى ذلك، يتم التحكم في عملية ترجمة البروتين ويؤثر في نهاية المطاف على التعبير الإنزيم وبالتالي النشاط. يمكن تقدير الآثار المجتمعة للخطوات التنظيمية المشار إليها أعلاه باستخدام فحوصات التعبير كمية البروتين، مثل “النشاف الغربية” أو المرحلة عكس البروتين ليستي [ميكروارس]، أو فحوصات التعبير البروتين النوعي، مثل إيمونوسيتوتشيميستري وإيمونوهيستوتشيميستري، ولكن هذه التقنيات تعجز عن إدماج الآثار التنظيمية المصب مثل تعديل بوستترانسلاشونال للبروتينات واللائحة الوظيفية للإنزيمات في المكروية مزدحمة بهم. وعلاوة على ذلك، التعبير عن إنزيم قد سيئة ترتبط بنشاطها، حتى أن قياسات النشاط إنزيم المنقي في هوموجيناتيس الخلايا أو الأنسجة أو حلول مخففة تستخدم على نطاق واسع للدراسات نشاط الإنزيم. ومع ذلك، تفشل هذه التجارب لتكرار تأثير السيتوبلازم مجزأة مزدحمة أو عضية على نشاط إنزيم. وعلاوة على ذلك، تحديد الكمية أو إضفاء الطابع المحلي على التعبير مرناً أو إنزيم جميع التقنيات المذكورة أعلاه، ولكن غير قادر على إعطاء معلومات شاملة عن كل جوانب هذه التعبير الإنزيم، ناهيك عن إدماج هذا المعلومات مع قرارات نشاط الإنزيم. ^{2 , 3 , 4}

تعيين الأيضية يسمح التقدير لكل من المتغيرات المذكورة آنفا التي تحدد نشاط إنزيم. ما هو أكثر من ذلك، هو تعيين الأيضية شكلاً من أشكال الخلايا الحية أو تصوير الأنسجة مع الخلايا والأنسجة التي يتم الاحتفاظ بها سليمة أثناء تحليل لتوليد حالة تقريبا صحيح لطبيعة لتوليد بيانات نشاط الإنزيمات. وتنتج الصور التي تسهل كل تقدير مفصل موقع نشاط إنزيم، فضلا عن قوي التحديد الكمي لنشاط إنزيم داخل حجرة الخلايا أو الأنسجة. ^{3 , 4} البروتوكولات المبينة هنا لرسم خرائط الأيضية لنشاط dehydrogenases تستند على دليل المختبرات كافة أساليب histochemical الإنزيم المتاحة،⁵ في مبادئ كمية الإنزيم هيستوتشيميستري،⁶ وفي تحليل الصور من الخرائط الكمية الأيضية. ⁴

ديهيدروجيناسيس هي الإنزيمات التي تقوم بتفاعلات الأكسدة والاختزال لتقليل العوامل المساعدة المتعارف عليه مثل NAD⁺، NADP⁺ وبدعة إلى NADH ونادف والقوات المسلحة الهايتية₂، على التوالي. هي المحتضنة خلايا سليمة أو أقسام الأنسجة كريوستات التي هي غير ثابتة كيميائيا في متوسط رد فعل الذي يتضمن، بين الكواشف الأخرى، والركيزة، والعوامل المساعدة من نازعة محددة وملح تيترازوليوم. وفي وقت لاحق، أن نازعة ينفذ نشاط الحفاز ويقلل من NADP⁺ إلى نادف، على سبيل المثال،. عبر ناقلة إلكترون، تخفيض 2 نادف الجزيئات في نهاية المطاف 1 جزيء الملح tetrazolium شبه عديم اللون للذوبان في الماء في جزيء 1 formazan الأزرق تستعصي على الحل المياه رواسب فورا في موقع نازعة. ولذلك، امتصاص formazan سرع مقياسا مباشرا للنشاط المحلي لنازعة ويمكن ملاحظتها باستخدام الفحص المجهري الخفيفة أو كمياً باستخدام تحليل الفحص المجهري وصورة الضوء أحادي اللون. الجانب الكمي لهذا البروتوكول يتيح للباحثين ﻻستخﻻص النتائج الإحصائية من هذه الاختبارات. وبالإضافة إلى ذلك، يسهل هذا التحديد الكمي البت في الموقع معلمات إنزيم الحركية، مثل نشاط إنزيم القصوى (V_max) وتقارب من الركازة لأنزيم (ك_م). ^{3 , 4 , 5 , 6}

عند التخطيط لتجربة تعيين ايضية، من المهم أن ندرك أن كل تجربة، ويوصي بحد أقصى خمسين الشرائح الزجاجية مع المنضمة خلية الأعمال التحضيرية أو أقسام الأنسجة لتقليل التأخيرات الزمنية أثناء الحضانة من أجل الحصول على متسقة النتائج. فمن الممكن عملية أكثر الشرائح و/أو التراكيب المتوسطة عندما تنفذ هذه الخطوات بروتوكول تعاوني بالمجرب أكثر. وعلاوة على ذلك، يوجد بعض التغير بين التجارب. ولذلك، يجب تكرار تجارب مماثلة على الأقل 3 مرات مع سيتوسبينس من كل إعداد الخلية أو مقاطع من كل عينة الأنسجة وضوابط ملائمة ينبغي أن تدرج في كل تجربة. دائماً إعداد وسيلة احتضان تحكم في غياب الركيزة ولكن وجود العوامل المساعدة على مراقبة لتلطيخ نشاط إنزيم غير محددة. النتائج الأكثر تمثيلاً يتم الحصول عليها في تجارب فيه تركيزات مختلفة الركازة/مساعد يتم تطبيقها على أقسام الأنسجة أو الخلايا الاستعدادات من نفس العينة، حيث أن المجرب يمكن إجراء تحليلات لأنزيم حركية استخدام منحنيات جرعة النشاط.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية المتعلقة باستخدام المواد البشرية “المجلس استعراض” الأخلاقيات الطبية من المركز الطبي الأكاديمي. 1-إعداد الخلايا أو أقسام الأنسجة الخلايا تريبسينيزي الخلايا من أطباق الثقافة باستخدام 1 مل من 0.25% التربسين-يدتا لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في 10 مم طبق بيتري وجلب خلايا في تعليق 37 درجة مئوية 50,000 200,000 خلايا/مل، اعتماداً على حجم الخلايا. إرفاق 200 ميليلتر من تعليق خلية على شرائح مجهرية باستخدام مداخل سيتوسبين في سيتوسينتريفوجي في 20 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أيردري سيتوسبينس على 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وهذا لا يؤثر على النشاط نازعة. 5 أقسام الأنسجة استخراج النسيج من المرضى أو الحيوانات وفقا لتصاريح الأخلاقية. 10 ملم3 من الأنسجة غير كافية لتجارب متعددة. وضع قطعة الأنسجة في قنينات بلاستيكية صغيرة تنفيس 2 مل والمفاجئة-تجميد قارورة تحتوي على قطعة الأنسجة في نيتروجين سائل. تخزين قارورة تحتوي على قطعة النسيج في −80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة. استخدام متوسطة مثل هلام تسمى درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) لتحميل عينة الأنسجة على تشاك أن يتجمد وصولاً إلى-20 درجة مئوية إلى-25 درجة مئوية سريعاً، حيث أن المياه لا يمكن أن تشكل بلورات. استخدام كريوستات لقطع وأول تقليم الكتلة إلى المستوى المطلوب (مثالي الزجاج نصف عرض الفحص المجهري الشريحة، مثل 5 مم × 5 مم). على تمزيقها، استخدام الفرش وصفيحة لفة المضادة لمنع المقاطع من الشباك صعودا. قطع عينات الأنسجة إلى 6-10 ميكرون سميكة المقاطع بسرعة بطيئة ولكن ثابتة (1 ثانية لكل قسم). عند قطع مقطع بشكل صحيح، يبقى شقة على السكين مبضع تحت صفيحة لفة لمكافحة. التقاط الأجزاء 1-3 على الشرائح الزجاجية تقنيين وتخزينها في −80 درجة مئوية حتى الاستخدام. عدد المقاطع التي أعدت يعتمد على حجم العينة الأنسجة وسمك المقاطع المطلوبة. 2-إنزيم Histo/سيتوتشيميستري ل Dehydrogenases القابلة للذوبان إعداد رد فعل المخزن المؤقت. تحضير 100 مل من المخزن المؤقت للفوسفات من الرقم الهيدروجيني الصحيح (انظر الجدول 1؛ قد كل إنزيم درجة حموضة مثلى التي نشاطها هو أعلى). على سبيل المثال، مزيج من الحلول من 0.1 م خ2ص4 (الحمضية) و 0.1 م غ2هبو4 (الأساسية) حتى يتم إجراء مخزن مؤقت مع درجة الحموضة الصحيح. تزن 18 جرام كحول البولي فينيل (PVA) في المخزن المؤقت للفوسفات تحت غطاء دخان كما بولي المغبرة والسامة. حل نسبة 18% w/v بولي في المخزن المؤقت للفوسفات في 100 درجة مئوية عن الاحترار المخزن المؤقت باين الاتحاد الأفريقي ماري (ضع الزجاجة الزجاج في الماء المغلي) والتحريك حتى يذوب تماما بولي. وسيكون الحل شفافة، ثم مع فقاعات الهواء الصغيرة التي تسببها الإثارة. وهي تتطلب عادة ~ 15 دقيقة لبولي بحل.ملاحظة: نسبة 18% w/v بولي في المخزن المؤقت للفوسفات اللزوجة ويمكن نقلها إلى رد فعل 15 مل العازلة أنابيب ماصة واسعة استخدام. يجب أن تحدث التخزين القصير الأجل من 18% w/v بولي في المخزن المؤقت للفوسفات في إيه فور زيرو درجة مئوية والتخزين طويل الأجل (تصل إلى 2 أسابيع) في ≥ 60 درجة مئوية. 250 ميليلتر من 18% w/v بولي في المخزن المؤقت للفوسفات مطلوب عادة لإعداد سيتوسبين، بينما ميليلتر 500 مطلوب لقسم أنسجة. إعداد الحل الملح (نيتروبت) تيترازوليوم. لكل 1 مل من الحضانة المتوسطة، 40 ميليلتر لحل نيتروبت المطلوب، تتكون من 5 ملغ نيتروبت (مسحوق أصفر) حلت في مزيج من 20 ميليلتر dimethylformamide (DMF) و 20 ميليلتر من الإيثانول، الذي سوف يكون حلاً شفافة صفراء خفيفة.ملاحظة: نظراً لاستقرار نيتروبت هو أدنى من الكواشف اللازمة كافة، من المستحسن إعداد الحل الأسهم نيتروبت آخر ويذوب في نيتروبت في المتوسط رد أولاً. حل نيتروبت في DMF والايثانول بتدفئة في قنينة زجاج خلال فترة قصيرة من الزمن (~ 10 s) باستخدام موقد بنسن. تهز القنينة أثناء التسخين ولا تترك القنينة وقتاً طويلاً في الشعلة لمنع التبخر. جعل 10 ٪ حل نيتروبت إضافية للسماح للتبخر من الإيثانول وثنائي ميثيل فورماميد أثناء عملية حل. درع ميثوسولفاتي فينازيني حاملات الإلكترون (PMS) أو (1-ميثوكس)-فينازيني ميثوسولفاتي (مبمس)، واحتضان الوسائط التي تحتوي على m(PMS) من الضوء المباشر بالتفاف ورق ألمونيوم حول القنينة تخزين الزجاج. إعداد الحلول كاشف وفقا الجدول 1 بتذويب لها في المقطر H2o. بعض الكواشف يهلك سريعاً، حتى إعداد منهم وقت قصير قبل التجربة قدر الإمكان. تبقى الحلول كاشف على الجليد أو عند 4 درجة مئوية حتى الاستخدام. تحضير الوسائط الحضانة كما هو مبين في الجدول 1 وتجانسه الحل بعد كل خطوة بالتحريك لطيف. تجنب توليد فقاعات الهواء في الأجلين المتوسط والحضانة بالتحريك باستمرار وإبقاء الملعقة تحت سطح المتوسطة الاحتضان أثناء التحريك. تطبيق الحضانة المتوسطة إلى أقسام الأنسجة شرائح مجهرية مسبقاً دافئة مع سيتوسبينس أو أقسام الأنسجة يعلق على 37 درجة مئوية في غرفة حضانة immunohistochemistry 15 دقيقة غمر الجزء السفلي من غرفة الحضانة إيمونوهيستوتشيميستري مع الماء الدافئ للحفاظ على درجة حرارة ثابتة في حاضنة. عناية كسر أو وداع الماصات باستور في الانتقال من الضيقة إلى الجزء على نطاق واسع. العادية باستور الماصات ضيق جداً لنضح المتوسطة الحضانة لزج، حيث هناك حاجة إلى هذه الخطوة جعل باستور الماصات واسعة بما يكفي لتطلع المتوسطة الحضانة. تطبيق 250-500 ميليلتر من المتوسطة الحضانة المناسبة لكل إعداد الخلية أو قسم الأنسجة على شرائح مجهرية باستخدام جزء واسع من ماصة باستور. استخدام تلميح ماصة انتشرت المتوسطة الحضانة بالتساوي. تجاهل فقاعات الهواء الصغيرة في الأجلين المتوسط والحضانة، لأن هذه سوف تطفو على السطح ولن تتداخل مع رد الفعل الأنزيمي في المقطع إعداد أو أنسجة الخلية على شريحة مجهرية. احتضان الخلية الأعمال التحضيرية أو أقسام الأنسجة على شرائح مجهرية في حاضنة 37 درجة مئوية (مثلاً حاضنة استنبات الأنسجة) لمدة محددة سلفا، اعتماداً على حركية إنزيم وتعبيرها في تحضير خلية معينة أو الأنسجة (الجدول 1). الحفاظ على الغطاء immunohistochemistry حضانة دائرة مغلقة للحفاظ على بيئة رطبة لمنع رد فعل المخزن المؤقت من الجفاف. الغسيل الشرائح المجهرية اضغط إيقاف المتوسطة الحضانة الزائدة في أنسجة. ميكانيكيا شطف المتوسطة الحضانة من الشرائح المجهرية في المخزن المؤقت للفوسفات 60 درجة مئوية، درجة الحموضة 5.3، بتحريك الشرائح المجهرية صعودا وهبوطاً في المخزن المؤقت. وهذا يتوقف رد الفعل الأنزيمي. تغسل شرائح مجهرية بإبقائها في المخزن المؤقت للفوسفات 60 درجة مئوية، درجة الحموضة 5.3 لمدة 20 دقيقة. ميكانيكيا يغسل الشرائح المجهرية في مياه الحنفية 60 درجة مئوية. تغسل شرائح مجهرية بإبقائها في مياه الحنفية 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. السماح للمياه والشرائح التي تبرد ببطء خلط مياه الحنفية في درجة حرارة الغرفة بماء الصنبور 60 درجة مئوية على مدى دقيقة واحدة. نفذ خطوة نهائية غسيل ميكانيكية في الماء في درجة حرارة الغرفة المقطر. أرفق سيتوسبينس الملون أو أقسام الأنسجة على شرائح مجهرية قبل الحارة شريحة الأكثر دفئا في 50-60 درجة مئوية. الجاف للجانب الخلفي من الشرائح المجهرية باستخدام منشفة ورقية ووضعها على الشريحة الأكثر دفئا الجاف للجانب العلوي من الشريحة مجهرية بعناية. عندما تكون الشرائح الجافة، أرفق خلية الأعمال التحضيرية أو أقسام الأنسجة على شرائح مجهرية استخدام والغليسيرول جيلي تصاعد المتوسطة وكوفيرسليبس. حفظ الخلية الأعمال التحضيرية أو شرائح مجهرية أقسام الأنسجة في الظلام في ثلاجة عند درجة 4 مئوية أو الشروع فورا في الحصول على الصور. 3. الحصول على الصور الربح سجل الصور مع كاميرا CCD أحادية اللون علمية مع مجموعة ديناميكية كافية (على الأقل 8 بت ولكن يفضل أن تكون 10-بت أو 12 بت،) ثابتة وردها خطي. حدد هدف الصحيح (20 X X-63 لسيتوسبينس)، والعاشر 10-63 لأقسام الأنسجة. تقليل التوهج بتضييق الميدان الحجاب الحاجز حيث أنها أكبر قليلاً من مجال الرؤية. استخدام تصفية الضوء أحادي اللون بتطبيق عامل تصفية استدلال نانومتر واسعة ممر الموجه 10 القرب من الطول الموجي إيسوبيستيك formazan المتعجل7 مقترنا حجب الأشعة تحت الحمراء (انظر الجدول المواد).ملاحظة: يتم امتصاص إيسوبيستيك الحد الأقصى من نيتروبت في 585 نانومتر. تحسين الإضاءة لضمان أن يتم استخدام مجمل مستوى رمادي الكاميرا (أي، تعيين مستوى الإضاءة حتى يتحقق أقصى الإضاءة دون الإفراط في تعريض عند تسجيل شريحة مجهر فارغة). معايرة قيم قياس مستويات الرمادي لامتصاص المعروفة (أو الكثافة البصرية [OD]). وتحقيقا لهذه الغاية، التقاط الصور الرمادية مقياس لمالا يقل عن 10 خطوات مختلفة للشرائح المعايرة أو خطوة اللوحي مع القيم OD المعروفة (راجع الخطوة 4.1.1)، أما متوفرة تجارياً (انظر الجدول المواد) أو قياس قرص خطوة آسفين مقياس رمادية مصنوعة خصيصا غراي دينسيتوفوتوميتير واستخدام النتائج لمعايرة قياس القيم إلى قيم امتصاص المعروفة. التقاط photomicrographs الخلايا أو أقسام الأنسجة للفائدة. 4. تحليل الصورة قبل تحليل الصور، معايرة البرمجيات ImageJ لامتصاص القياسات. قياس امتصاص (OD) من photomicrographs مالا يقل عن 10 مجالات المعايرة مع معلمات امتصاص المعروفة في اللوحة الشريحة أو الخطوة المعايرة مع القيم OD المعروفة. في إيماجيج، استخدام هوتكي Ctrl + M أو تحليل ← التدابير القائمة لقياس مساحة محددة. بدء إجراء المعايرة امتصاص عن طريق الذهاب إلى تحليل ← المعايرة. اختر دالة “رودبارد (صورة المعاهد الوطنية للصحة)”. في العمود الأيسر من النافذة التي تفتح، نتائج القياسات مستوى رمادية من كل خطوة اللوحة الشرائح/الخطوة المعايرة في 4.1.1 موجودة مسبقاً. إذا لم يكن الأمر كذلك، نسخة منها من شاشة النتائج إيماجيج. في العمود الأيسر، أدخل كل قيمة امتصاص المعروفة المقابلة كما المطبوعة على الشهادة التي تلقيتها مع الكمبيوتر اللوحي خطوة محسوبة. ضع علامة على مربعات “المعايرة العالمية” و “عرض الأرض” واضغط على “موافق”. لمراقبة الجودة، والتأكد من ص2 الدالة رودبارد > 0.99. إذا كان < 0.99، تحقق ما إذا كان تصوير الشرائح المعايرة وقياسها بشكل صحيح، وما إذا كانت المعلمات امتصاص معروفة تم إدخالها بشكل صحيح. الآن معايرة ImageJ حتى تقوم بإغلاق البرنامج (وبالتالي “المعايرة العالمية”). لامتصاص القياسات، جلسة ImageJ معايرة دائماً يحول يعني امتصاص الملحوظ للقيم بين 0 و 1، حيث 0 و 1 هي المقاربة الصفر وكامل امتصاص، على التوالي. بالنسبة سيتوسبينس، حدد > 100 خلية واحدة بطريقة عشوائية. لأقسام الأنسجة، حدد واحد أو أكثر من الحقول ذات طول ثابت وعرض في جميع الأقسام. مشروع نقطية على مدى photomicrographs للمساعدة في التحديدات الخلية غير متحيزة. في إيماجيج، مشروع شبكة أكثر من صورة عن طريق الإضافات ← تحليل ← الشبكة القائمة. في إيماجيج، استخدم “أداة البيضاوي” لتحديد الخلايا المفردة، واستخدام “الأداة مستطيل” لتحديد مناطق الأنسجة. قياس امتصاص ومنطقة الخلايا المحددة أو مناطق الأنسجة. الكثافة البصرية ومنطقة تسمى “تعني” ونتائج “المنطقة” في إيماجيج جدول البيانات، على التوالي.ملاحظة: امتصاص مجموع منطقة الخلايا أو الأنسجة (إذا قمت بتحديد عدة مناطق الأنسجة بأحجام مختلفة) يساوي مجموع كل بكسل المنفصلة أبسوربانسيس. إذا كان يتم تصويرها خلية من 1000 بكسل، ثم تعطي امتصاص الإجمالية بمبلغ 1000 أبسوربانسيس وتعطي امتصاص يعني بمجموع امتصاص/1000. ويتجنب هذا الإجراء أيضا خطأ في التوزيع. تحديد امتصاص مجموع متوسط من > 30 خلايا أو أنسجة المناطق من slide(s) عنصر التحكم، التي تحتوي على نموذج التي تعرضت للتحكم المتوسطة الحضانة في غياب الركيزة ولكن وجود العوامل المساعدة. تستخدم للتحكم في امتصاص عنصر التحكم هذا لتلطيخ نشاط إنزيم غير محددة وامتصاص الآثار الناجمة عن الشرائح المجهرية المستخدمة، تصاعد المتوسطة، وكشف الغطاء أو المجهر. طرح امتصاص التحكم متوسط من جميع القياسات امتصاص مجموع العينات التي تعرضت للحضانة المتوسطة مع نفس تركيز مساعد (لكن تركيزات مختلفة من الركازة و/أو المانع). وهذا يعطي امتصاص مجموع المصوبة لمنطقة الخلايا أو الأنسجة. قارن إحصائيا absorbances مجموع تصحيح متوسط استخدام الاختبار T للطالب أو اختبار ANOVA أحادي الاتجاه، اعتماداً على التصميم التجريبي الخاص بك. امتصاص فورمازان يمكن أن تتحول إلى نشاط إنزيم (µmol تحويل الركازة كل مل في الدقيقة) استخدام قانون بير لامبرت: c=A/(є×d)، حيث c هو تركيز فورمازان على المديين المتوسط ورد فعل، وهو امتصاص المقاسة في إيماجيج بعد المعايرة؛ Є هو معامل الانقراض formazan (16.000 في 585 nm)8 ود هو الضوء السفر المسافة، ومساو لسمك متوسط الخلية أو قسم الاسمية قطع سمك (6-10 ميكرون في هذا البروتوكول).ملاحظة: بعد التجفيف، يقلل سماكة قسم الأنسجة ~ 50% من سمك قطع المقطع الأسمى، ولكن هذا لا ينعكس في الحساب أعلاه نظراً لسمك قطع المقطع الأسمى هو بيولوجيا أكثر صلة. خلية متوسط سمك وأبعاد المجال خلية بريباراتيس التقيد بشرائح زجاجية مجهرية يمكن تحديد استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] أو مجهرية واسع المجال، الذي البروتوكولات ويمكن الاطلاع على أماكن أخرى. 9 , 10

Representative Results

وترد عدة بروتوكولات لإعداد المتوسطة الحضانة للتحقيق في نشاط نازعة خاصة. لكل من نازعة، حل الكواشف المذكورة في الحل بولي مع الحفاظ على درجة حرارة على الأقل 37 درجة مئوية. الكواشف ينبغي أن تحل بالترتيب المحدد في الجدول و أي نيتروبت دائماً يحل أولاً (م) الدورة الشهرية دائماً حل آخر. يتم حل كل 5 ملغ من نيتروبت في مزيج ميليلتر 40 (20 ميليلتر الإيثانول + 20 ميليلتر dimethylformamide). كافة وحدات التخزين لكل 1 مل من محلول بولي 18%، التي يمكن استخدامها لوصمة عار ~ 2 أقسام الأنسجة أو ~ 4 خلية الاستعدادات على الشرائح الزجاجية. نيتروبت نادٍ+، NADP+، ينبغي بذل الحلول ADP والركيزة الطازجة. نان3ومجكل2 (م) الدورة الشهرية حلول يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد. 18% بولي حله في الفوسفات ويمكن تخزين المخزن المؤقت عند 60 درجة مئوية لمدة أسبوعين. يمكن تعيين الرقم الهيدروجيني للحل بولي 18% باستخدام تركيبات مختلفة من فوسفات هيدروجين البوتاسيوم 0.1 M (خ2ص4) و 0.1 M ثنائي الهيدروجين الفوسفات (نا2هبو4) المخازن المؤقتة. فترات حضانة أظهرت توفر نقطة انطلاق جيدة، ولكن فترات حضانة المثلى تعتمد على الأنواع ونوع الأنسجة والحفاظ على النسيج. وبصفة عامة، ينبغي المحتضنة الاستعدادات خلية أطول من أقسام الأنسجة للحصول على مستوى مماثل لإنتاج فورمازان. نازعة إيسوسيتراتي البرية من نوع 1 و 2 (IDH1/2) تحفيز تحويل إيسوسيتراتي إلى α-كيتوجلوتاراتي (αKG) مع ما يصاحب ذلك انخفاض NADP+ إلى نادف في السيتوبلازم والميتوكوندريا، على التوالي. هذه الإنزيمات وقد اجتذبت اهتمام مؤخرا نظراً لحدوث الطفرات IDH1/2 في أنواع مختلفة من السرطان البشري، بما في ذلك سرطان الدماغ الأولية (جليوبلاستوما)، وسرطان القولون والمستقيم، وتوفر فرصة فريدة لإظهار إمكانيات تعيين الأيضية. الطفرات IDH1 تعطيل نشاط إنزيم البرية من نوع IDH1 وحمل أيضا نشاطا الجدد الانزيمية التي تؤدي إلى إنتاج وتراكم اللاحقة من أونكوميتابوليتي د-2-هيدروكسيجلوتاراتي (د-2 HG)،11 وناقش في أماكن أخرى بالتفصيل. 12 وأظهرت التجارب الأيضية رسم الخرائط أن NADP+-تعتمد IDH1/2 النشاط كان أقل بكثير في خلايا سرطان القولون والمستقيم مع طرقت في متخالف IDH1 طفرة من خلايا سرطان القولون والمستقيم التي كانت IDH1 البرية من نوع (الشكل 1A). كان هذا الاختلاف كمياً بتحليل الصورة photomicrographs الضوء أحادي اللون (الشكل 1B). 12 ويرد مثال آخر يوضح التجارب الأيضية رسم الخرائط في الشكل 2، والذي هو صورة لمقطع كريوستات الدماغ الماوس التي تم حقن الخلايا جليوبلاستوما البشرية. IDH1/2 هو موفر نادف الأكثر أهمية في الدماغ البشري ونشاطها أوبريجولاتيد في البرية من نوع جليوبلاستوما IDH1/2 ، بينما قدرة إنتاج نادف IDH1/2 أقل بكثير في أدمغة القوارض. 11 الشكل 2A يظهر الفرق بين NADP عالية+-يعتمد نشاط IDH1/2 في الخلايا جليوبلاستوما البشرية و NADP منخفض+-تعتمد IDH1/2 النشاط في الدماغ صحية الماوس. النشاط IDH1/2 هو كمياً كإنتاج نادف µmol كل مل الأنسجة الدقيقة في الشكل 2. رد فعل الانزيمية IDH1/2 بسيط نسبيا، ولكن نازعة لاكتات (رابطة حقوق الإنسان) إنزيم أكثر تعقيداً معقدة. رابطة حقوق الإنسان يحول تحويل عكسها من اللاكتات إلى بيروفات مع ما يصاحب ذلك انخفاض NAD+ إلى NADH أو العكس بالعكس. توافر لاكتات وبيروفات وتكوين الإنزيم رابطة حقوق الإنسان المعقدة ويملي سواء لاكتات يتم تحويلها أساسا إلى بيروفات (الذي هو تحفزها رابطة حقوق الإنسان-ب وغلات NADH) أو ما إذا كان يتم تحويل بيروفات أساسا إلى لاكتات (والذي تحفزها رابطة حقوق الإنسان، ويستهلك NADH). تجارب تعيين 13 الأيضية قادرون على تصور نشاط رابطة حقوق الإنسان-ب رد فعل، لكنها “الأعمى” لنشاط رابطة حقوق الإنسان-برد فعل لأنه لا يحدث إنتاج NADH ونتيجة لذلك لم يتم خفض نيتروبت إلى فورمازان. ويبين الشكل 3 NAD+-الفرعين يعتمد نشاط رابطة حقوق الإنسان (أي تحويل اللاكتات إلى بيروفات) في الدماغ البشري في غياب الركيزة (الشكل 3 ألف)، وجود تركيزات عالية من لاكتات (الشكل 3B )، وحضور لاكتات 6 مم (الشكل 3)، وحضور تركيز منخفض من لاكتات وتركيز أعلى من بيروفات (3D الشكل). وتوضح نتائج هذه التجارب الأيضية رسم الخرائط على نحو كاف يلتقط أن ند+-يعتمد نشاط رابطة حقوق الإنسان في أقسام الأنسجة يعتمد على توافر لاكتات وبيروفات في الأجلين المتوسط ورد فعل. الشكل 1 . NADP+-IDH1/2 يعتمد نشاط الخلايا البشرية سرطان القولون والمستقيم. Photomicrographs (A) الضوء أحادي اللون الممثل HCT116 الخلايا البشرية سرطان القولون والمستقيم بعد تلطيخ ل NADP+-يعتمد نشاط IDH1/2 ضد 1-10 مم إيسوسيتراتي و 0.8 ملم NADP+. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. (ب) إجراء تقييم كمي لامتصاص فورمازان الأزرق ينتج من نيتروبت من NADP+–يظهر النشاط IDH1/2 تعتمد كل خلية باستخدام الضوء أحادي اللون في (أ) وتحليل الصور. المختصرات: IDH1WT/WT، نازعة إيسوسيتراتي 1 البرية من نوع؛ IDH1WT/موت، نازعة إيسوسيتراتي 1 تحور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2 . NADP+-يعتمد نشاط IDH1/2 من عينات جليوبلاستوما البشرية. (أ) الصورة المجهرية ممثل قسم الدماغ الماوس يحتوي على الماوس صحية الدماغ (ح) ومن إكسينوجرافت ورم جليوبلاستوما بشرية (t) بعد تلطيخ ل NADP+-النشاط IDH1/2 يعتمد حضور 0.8 مم NADP+ وإيسوسيتراتي 2 مم. شريط المقياس = 200 ميكرومتر (ب) إنزيم النشاط الكمي لمناطق الدماغ الماوس (ح) وجليوبلاستوما البشرية إكسينوجرافت (t) المبينة في (أ) باستخدام قانون بير لامبرت. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3 . NAD+-النشاط يعتمد لاكتات نازعة (رابطة حقوق الإنسان) من عينات المخ البشري. Photomicrographs الممثل من مقاطع المسلسل لعينات المخ البشري بعد تلطيخ لند+-يعتمد نشاط رابطة حقوق الإنسان (أ) ضد ظروف التحكم (في غياب الركيزة وبيروفات، 3 مم NAD+ فقط) (ب) ضد لاكتات 150 مم في غياب بيروفات (ج) ضد 6 مم لاكتات في غياب بيروفات و (د) ضد لاكتات 6 مم حضور 18 ملم بيروفات، مثبط تنافسية المنتج من رد فعل اللاكتات إلى بيروفات. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- إنزيم: G6PDH رابطة حقوق الإنسان تشبيك ضوئي متزامن MDH IDH1 IDH2 IDH3 6PGD جد بولي 18% في المخزن المؤقت للفوسفات 100 مم 1 مل؛ pH = 7.4 1 مل؛  pH = 7.4 1 مل؛  pH = 8.0 1 مل؛ pH = 7.4 1 مل؛ pH = 7.4 1 مل؛ pH = 7.4 1 مل؛ pH = 7.4 1 مل؛ pH = 8.0 1 مل؛ pH = 8.0 5 مم نيتروبت مزيج ميليلتر 5 ملغ/40 مزيج ميليلتر 5 ملغ/40 مزيج ميليلتر 5 ملغ/40 مزيج ميليلتر 5 ملغ/40 مزيج ميليلتر 5 ملغ/40 مزيج ميليلتر 5 ملغ/40 مزيج ميليلتر 5 ملغ/40 مزيج ميليلتر 5 ملغ/40 مزيج ميليلتر 5 ملغ/40 5 مم نان3  10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 5 مم مجكل2 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 3 مم NAD+ 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 0.8 ملم NADP 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 2 مم ADP 10 ميليلتر الركيزة 10 ملم الجلوكوز-6-فوسفات لاكتات 150 مم succinate 50 مم حمض malic 100 مم إيسوسيتراتي 2 مم إيسوسيتراتي 2 مم إيسوسيتراتي 2 مم 10 ملم 6-والرمات-جالاكتوناتي حمض الغلوتاميك 10 ملم مبمس 0.32 مم 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 0.2 مم الدورة الشهرية 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر 10 ميليلتر مدة حضانة المرض 5 دقيقة 30 دقيقة 60 دقيقة 60 دقيقة 30 دقيقة 30 دقيقة 30 دقيقة 10 دقيقة 30 دقيقة الجدول 1. نظرة عامة على التخطيطي البروتوكول رسم الخرائط الأيضية ل dehydrogenases. المختصرات: ADP أدينوسين ديفوسفاتي؛ (م) الدورة الشهرية (ميثوكس)-5-كبريتات ميثيلفينازينيوم الميثيل؛ نيتروبت، كلوريد تيترازوليوم الأزرق نيترو؛ G6PDH، نازعة الجلوكوز-6-فوسفات؛ رابطة حقوق الإنسان، لاكتات نازعة؛ المحددات، نازعة succinate؛ MDH، نازعة مالات؛ IDH، نازعة إيسوسيتراتي؛ 6PGD، نازعة 6-فوسفوجلوكوناتي؛ جد، نازعة غلوتامات.

Discussion

البحوث المتعلقة بالأيض الخلوية تشهد حاليا نهضة للباحثين يدركون الآن أن الآثار الأيضية من أهمية حاسمة في نشوء المرض وعلاج الكثير من الأمراض. وبمساعدة من ¹ أبحاث الأيض وعلاوة على ذلك، قبل زيادة توافر التقنيات التي توفر هذا الحقل من البحث مع أدوات أكثر من أي وقت مضى، بما في ذلك الطيف الكتلي والعلامات راديويسوتوبيك والقياس الطيفي الرنين المغناطيسي النووي. لا حال من الأحوال تعيين الأيضية تقنية رواية، ولكن قدرتها على إعطاء معلومات متكاملة عن النشاط الإنزيمات في حالة تقريبا صحيح لطبيعة يجعل هذا الأسلوب أكثر أهمية من أي وقت مضى. ²

وتوجد في جميع الخلايا الحية، مما يشير إلى أن dehydrogenases نشأ في وقت مبكر جداً خلال تطور العوامل المساعدة⁺ NAD و NADP⁺ ولها أدوار رئيسية في الأيض الخلوي. ^{14 ,} حاليا، هناك ¹⁵ 523 ردود فعل تحفيز الإنزيم التي تصنف على أنها ديهيدروجيناسيس وتحدث عبر جميع الأنواع. ¹⁶ نظرياً، نشاط جميع ردود فعل مختلفة من نازعة يمكن بشكل منفصل بالتحقيق اللف البروتوكول الأيضية رسم الخرائط الموضحة هنا. كل رد فعل الانزيمية فريدة من نوعها عن طريق الركيزة والعوامل المساعدة اللازمة لنشاطها. ولذلك، يمكن تحديد نشاط كل رد فعل الانزيمية استخدام تجربة تعيين ايضية مع الركازة الملائمة والعوامل المساعدة على المديين المتوسط ورد الفعل. بيد أن بعض isoforms الإنزيم تختلف في هذه الترجمة سوبسيلولار، مثل واحد isoform يحفز رد فعل في السيتوبلازم بينما isoform آخر يعمل في الميتوكوندريا. مثال جدير بالذكر هو IDH1 و IDH2، التي السابق هيولى وهذا الأخير mitochondrial واثنين من البروتينات المختلفة المشفرة بواسطة اثنين من جينات مختلفة. ¹¹ 1-ميثوكس-5-ميثيلفينازينيوم ميثيلسولفاتي (ميثوكس-PMS) و 5-ميثيلفينازينيوم ميثيلسولفاتي (PMS) يمكن استخدام كل كحاملات إلكترون لهذه التجارب. السابق لا يمر المتقدرية الأغشية، هذا الأخير. ولذلك، يجب استخدام التحقيقات على إنزيمات الميتوكوندريا (مثل IDH2) الدورة الشهرية بينما التحقيقات على إنزيمات سيتوسوليك (مثل IDH1) وينبغي أن تستخدم مبمس.

كما هو الحال مع العديد من التقنيات، اختلافات من هذا البروتوكول، مثل استخدام أنواع مختلفة من الأملاح تيترازوليوم، باستثناء إضافة الدورة الشهرية وأزيد الصوديوم، استخدام وسيلة متزايدة مائي، واختلاف الاحتضان والشطف مرات، موجودة، وقد تعمل بشكل جيد على قدم المساواة. لا يقتصر تطبيق رسم الخرائط الأيضية مع أملاح تيترازوليوم إلى ديهيدروجيناسيس. مع تعديلات صغيرة إلى البروتوكول، يمكن أيضا استخدامه لتقييم نشاط الإنزيمات التي تعمل مباشرة المنبع لنازعة في مسار الأيض. لقد قمنا سابقا بوصف هذا المبدأ للانزيم جلوتاميناسي،¹⁷ التي تعمل مباشرة المنبع من نازعة غلوتامات في مسار جلوتامينوليسيس. ¹⁸ من الناحية النظرية، يمكن تطبيق نفس المبدأ للإنزيمات الأخرى أن دورة الدالة مباشرة المصب أو المنبع لنازعة مثل أكونيتاسي، التي تقع مباشرة أعلى النهر IDH2 و IDH3 في حامض تريكاربوكسيليتش (TCA). اختلاف بسيط آخر هو التركيز المبينة في الجدول 1 عن طريق جعل حضانة قنينة متوسطة بتركيزات مختلفة من الركازة، مساعد و/أو مثبط. يسمح هذا جيل منحنيات جرعة النشاط كدالة لتركيز الركازة، مساعد و/أو تثبيط.

يتحدث من الناحية الفنية، الأيضية والتجارب رسم الخرائط لا تيسر الملاحظات غير متحيزة في الموقع نشاط الإنزيم، للباحثين لاختيار تركيز الركيزة ومساعد قد لا تعكس مستويات الركيزة ومساعد أن يتم هذا في الموقع. وعلاوة على ذلك، استخدام لزج 18% بولي في الأجلين المتوسط ورد فعل يساعد على إبقاء الجزيئات سليمة، في المكان وفي تكيف ولكن يحظر نشر فعالة من الكواشف الوزن الجزيئي المنخفض من خلال وسيلة رد فعل. ^{3 , 5} ولذلك أنشطة إنزيم العزم في التجارب الموضحة هنا أن استخدام تركيزات الركيزة سوبرافيسيولوجيكال لا تعكس الحالة في فيفو بتركيز الركازة معين بل مناسبة مقارنات بين التجريبية. وبالتالي، من نتائج تجارب رسم الخرائط الأيضية قدرة الإنتاج (أقصى نشاط) فعل الانزيمية في السياق مستويات الركيزة ومساعد الموجودة على هذا الموقع. وعلاوة على ذلك، يتيح استخدام تركيزات مختلفة من الركازة و/أو العوامل المساعدة وعينات متعددة غير متحيزة مقارنة بالطاقة الإنتاجية القصوى (V_max) وتقارب (ك_م) من إنزيم الركازة/مساعد في الأعمال التحضيرية للخلية ، الأنسجة أو مناطق الأنسجة. هذه المعلمات هي نتيجة لمجموع إنزيم البروتين التعبير والتعديلات بوستترانسلاشونال وأثر المكروية مزدحمة على نشاط الإنزيمات. ولذلك، تعيين الأيضية لا تزال انعكاسا أفضل لنشاط إنزيم من التجارب التي تحدد التعبير البروتين أو تنقية إنزيم النشاط في المختبر.

Materials

Adenosine 5′-diphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	A2754
D-Glucose 6-phosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	G7879
Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4)	Merck Millipore	106559
di-Sodium succinate	Sigma-Aldrich	W327700
DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	I1252
D-Malic acid	Sigma-Aldrich	2300
Glycerol Gelatin	Sigma-Aldrich	GG1
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1251
Lithium 6-phospho-D-galactonate	Sigma-Aldrich	55962
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
methoxy-Phenazine methosulfate	Serva	28966.01
Nicotinamide adenine dinucleotide	Sigma-Aldrich	N0505
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate	Sigma-Aldrich	NADP-RO
Nitrotetrazolium Blue chloride	Sigma-Aldrich	N6876
Phenazine methosulfate	Serva	32030.01
Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed	Sigma-Aldrich	P1763
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Merck Millipore	104873
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium L-lactate	Sigma-Aldrich	L7022
Bandpass filter	Edmund optics		https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/
Grey-step wedge	Stouffer Industries		http://www.stouffer.net/TransPage.htm