جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار
Summary
جلد الإنسان يعمل كخط أول للدفاع ضد البيئة الخارجية. نحن نقدم طريقة لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار. هذه الخلايا الكيراتينيه معزولة هي مفيدة في الأجهزة التجريبية العديدة، وهي نموذج مناسب جداً لدراسة الآليات الجزيئية في البيولوجيا الجلدي في المختبر.
Abstract
والوظيفة الرئيسية للخلايا الكيراتينيه توفير السلامة الهيكلية للبشرة، وبالتالي الحفاظ على حاجز ميكانيكية على العالم الخارجي. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا الكيراتينيه تلعب دوراً أساسيا في البدء، والصيانة، وتنظيم الاستجابات المناعية البشرة بكونها جزءا من نظام المناعة الفطرية الاستجابة للمحفزات مستضدي بطريقة سريعة وغير محدد. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار، وتبين أن هذه الخلايا تستجيب للتمايز المحطة الطرفية المستحثة بالكالسيوم، الذي يقاس بتعبير زيادة من إينفولوكرين علامة تمييز. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تبين أن الخلايا الكيراتينيه معزولة تستجيب لتفعيل مسارات الإشارات داخل الخلايا التي يسببها 1β إيل مقاسا بتنشيط p38 MAPK المسار. أخذت معا، يصف لنا طريقة للعزل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار. لأن الخلايا الكيراتينيه نوع الخلية الغالبة في البشرة، يعد هذا الأسلوب مفيداً لدراسة الآليات الجزيئية في البيولوجيا الجلدي في المختبر.
Introduction
الجلد هو أكبر جهاز في جسم الإنسان، ويعمل كحاجز وقائي ضد البيئة الخارجية. ويتألف الجلد من طبقتين الرئيسية: الأدمة والبشرة، حيث يشكل البشرة الطبقة الخارجية من الجلد. نوع الخلية الأكثر وفرة في البشرة من الخلايا الكيراتينيه تتألف من أكثر من 95% من الخلية الجماعية1،2. يتم الاحتفاظ بمراحل مختلفة من التمايز في البشرة الخلايا الكيراتينيه ويتم تنظيمها في الطبقات القاعدية والشائكة والحبيبية، وكورنيفيد التي تتوافق مع مراحل محددة من التمايز3. الوظيفة الأساسية للخلايا الكيراتينيه لتوفير السلامة الهيكلية للبشرة، وبالتالي إنتاج حاجز سليمة للعالم الخارجي.
الخلايا الكيراتينيه أيضا تمثل الخط الأول للدفاع ضد العوامل الممرضة في الجلد، وذلك دوراً هاما في الاستجابة المناعية الفطرية4،5. تعرض الخلايا الكيراتينيه للمنبهات الخارجية يؤدي إلى تفعيل مسارات الإشارات داخل الخلايا، وفي وقت لاحق، إنتاج عدد من الوسطاء التهابات مختلفة بما في ذلك السيتوكينات والمستقطبات الببتيدات المضادة للميكروبات. هذه البروتينات المشتقة من keratinocyte المشاركة في الاستجابة الالتهابية عن طريق تجنيد وتفعيل الخلايا المناعية مثل الخلايا الجذعية، العَدلات، وخلايا T محددة6،7. وهكذا، لأن الخلايا الكيراتينيه تلعب دوراً حاسما في العديد من العمليات البيولوجية، كان الأساس المنطقي لهذه التقنية المقدمة هنا لإنشاء نموذج في المختبر لدراسة البيولوجيا الجلد. كثيرا ما تستخدم الثقافات keratinocyte الأولية التي تم الحصول عليها من حديثي الولادة القلفة لدراسة البيولوجيا الجلد8،9. ومع ذلك، مع الأسلوب الموصوفة هنا، الكيراتينيه من كلا الجنسين يتم الحصول عليها أدى تنوع البيولوجي أعلى من الخلايا.
نقدم هنا، بروتوكول مفصل لعزله وجيل من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار، بما في ذلك الصيانة وتجميد الخلايا الكيراتينيه. والهدف العام لهذا الأسلوب هو توليد الكيراتينيه البشرية الأساسية التي يمكن استخدامها كنموذج لدراسة البيولوجيا الجلدي في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف كيفية عزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار بسهولة، وكيف أن الثقافة لهم في المختبر. هذا النموذج يمكن أن يكون أحد تطبيقات واسعة للتحقيق في بيولوجيا الخلايا البشرة، ويمكن أن يكون مفيداً للباحثين المهتمين بدراسة الأمراض الجلدية.
بعض المز?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر أنيت بلاك راسموسن ومولر كريستين على دعمها التقني
Materials
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | – |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | – |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | – | – | Forceps from any company can be used |
| Scissors | – | – | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | – | – | – |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | – | – | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | – |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | – |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
Referências
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. Keratinocytes as initiators of inflammation. Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A. Keratinocytes: key immunocytes of the integument. Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. Keratinocytes in inflammatory skin diseases. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
