成人皮肤角质形成细胞的生成与培养
Summary
人类皮肤作为抵御外部环境的第一条防线。我们提出了一种从成人皮肤中分离原代角质形成细胞的方法。这些孤立的角质形成细胞是有用的许多实验设置, 是一个非常适合的模型研究的分子机制在皮肤生物学体外.
Abstract
角质形成细胞的主要功能是提供表皮的结构完整性, 从而保持对外部世界的机械屏障。此外, 角质形成细胞扮演一个重要的角色, 在启动, 维护和调节表皮免疫反应的一部分, 是先天免疫系统反应抗原刺激的快速, 非特异性的方式。在这里, 我们描述了一个从成人皮肤分离的初级人类角质形成的协议, 并证明这些细胞反应钙诱导的终端分化, 通过增加表达的分化标记 involucrin。此外, 我们表明, 孤立的角质形成细胞是响应 IL-1β-induced 活化的胞内信号通路, 通过 p38 MAPK 通路的活化测量。我们一起介绍了一种从成人皮肤中分离和培养原代角质形成细胞的方法。由于角质形成细胞是表皮中的主要胞型, 因此该方法对皮肤生物学的分子机制 (体外) 的研究是有益的。
Introduction
皮肤是人体最大的器官, 是抵御外界环境的屏障。皮肤由两个主要层组成: 真皮和表皮, 表皮构成皮肤最外层。表皮中最丰富的细胞类型是角质形成细胞, 它包含95% 以上的胞质1,2。角质形成细胞保持在不同阶段的分化在表皮, 并组织成基底, 棘, 颗粒, 和 cornified 层, 对应的特定阶段的差异3。角质形成细胞的主要功能是提供表皮的结构完整性, 从而产生一个完整的屏障, 外部世界。
角质形成细胞也代表了第一行防御病原体在皮肤, 因此发挥重要作用的先天免疫反应4,5。角质形成细胞对外界刺激的暴露导致胞内信号传导通路的活化, 随后产生多种炎症介质, 包括细胞因子、趋化因子和抗菌肽。这些角质形成细胞衍生的蛋白质参与炎症反应, 通过招募和激活免疫细胞, 如树突状组织, 嗜中性细胞, 和特定 T 淋巴细胞6,7。因此, 由于角质形成细胞在许多生物过程中扮演着重要的角色, 这里提出的技术背后的基本原理是生成一个体外模型来研究皮肤生物学。从新生儿包皮中获得的原代角质细胞培养物通常用于研究皮肤生物学8,9。然而, 根据这里所描述的技术, 来自两性的角质形成细胞得到了更高的生物多样性。
在这里, 我们提出了一个详细的协议, 从成人皮肤分离和生成原人角质形成细胞, 包括维持和冷冻的角质。该方法的总目标是生成主要的人角质形成细胞, 可以作为一个模型来研究皮肤生物学体外。
Protocol
在接受整形手术的健康成人志愿者身上采集的皮肤样本需要得到所在机构伦理委员会的批准。该议定书得到了丹麦 Midtjylland 区域伦理委员会的批准 (M-20110027)。这里描述的方法来自 Maciaq et al.的类似研究10和刘和 Karasek11。 1. 从人的皮肤中分离角质形成细胞 首先提出以下解决方案:50 毫升溶液中0.25% 胰蛋白酶和0.1% 葡萄糖在 DPBS?…
Representative Results
钙诱导的末端分化人角质形成细胞接受治疗后, 钙14,15,16。主要的人角质形成细胞被隔离和培养, 如上述协议所述。当大约 50-60% 汇合, 细胞被刺激了与钙 (1.2 毫米) 或车和细胞的图片在天 0, 1 和2被采取了。图 1显示了在钙刺激下观察到的角质形成细胞的形态学变化。 <str…
Discussion
在这里, 我们描述了如何很容易地分离成人皮肤角质形成细胞, 以及如何培养他们在体外。该模型可以广泛应用于表皮细胞生物学的研究, 对研究皮肤疾病的研究有一定的参考价值。
这里所描述的协议的一些优点是, 与从接受包皮环切手术的新生儿包皮中分离出来的角质形成细胞相比, 成年患者的原始人角质产生者与男性和女性都是分离的。可以包括任何年龄≥18年。因?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者希望感谢安妮特布拉克拉斯穆森和汀穆勒的技术支持
Materials
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | – |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | – |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | – | – | Forceps from any company can be used |
| Scissors | – | – | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | – | – | – |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | – | – | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | – |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | – |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
Referências
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. Keratinocytes as initiators of inflammation. Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A. Keratinocytes: key immunocytes of the integument. Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. Keratinocytes in inflammatory skin diseases. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
Citar este artigo
Johansen, C. Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (130), e56863, doi:10.3791/56863 (2017).