Generatie en kweken van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid
Summary
De menselijke huid fungeert als een eerste lijn van verdediging tegen de externe omgeving. Presenteren we een methode voor het isoleren van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid. Deze geïsoleerde keratinocyten zijn nuttig in talrijke experimentele opstellingen en een zeer geschikt model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen in cutane biologie in vitro.
Abstract
De belangrijkste functie van keratinocyten is bedoeld als de structurele integriteit van de epidermis, waardoor het behoud van een mechanische barrière voor de buitenwereld. Bovendien, spelen keratinocyten een essentiële rol in de inleiding, het onderhoud en de regulering van epidermale immuunresponsen door die deel uitmaken van het aangeboren immuunsysteem reageert op antigene prikkels op een snelle en niet-specifieke wijze. Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid, en aantonen dat deze cellen op calcium-geïnduceerde terminal differentiatie, zoals gemeten door een verhoogde expressie van de differentiatie markering involucrin reageren. Bovendien laten we zien dat de geïsoleerde keratinocyten inspelen op IL-1β-geïnduceerde activering van intracellulaire signaalroutes zijn zoals gemeten door de activering van de p38 MAPK-pathway. Tezamen, beschrijven we een methode voor isolatie en kweken van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid. Omdat de keratinocyten de overheersende celtype in de opperhuid zijn, is deze methode handig om te bestuderen van de moleculaire mechanismen in cutane biologie in vitro.
Introduction
De huid is het grootste orgaan van het menselijk lichaam en dient als een beschermende barrière tegen de externe omgeving. De huid bestaat uit twee lagen: de dermis en de epidermis, waar de opperhuid de buitenste laag van de huid vormt. Het meest voorkomende celtype in de opperhuid is de keratinocyten bestaande uit meer dan 95% van de cel massa1,2. De keratinocyten worden onderhouden in verschillende stadia van differentiatie in de opperhuid en basale, stekelig, korrelig en cornified lagen die correspondeert met specifieke stadia van differentiatie3worden geordend. De primaire functie van keratinocyten is bedoeld als de structurele integriteit van de epidermis, waardoor het produceren van een intacte barrière tegen de buitenwereld.
De keratinocyten ook de eerste lijn van verdediging tegen ziekteverwekkers in de huid, en daarom een belangrijke rol spelen in het aangeboren immuun reactie4,5. Gasbedwelming met behulp van de keratinocyten externe prikkels leidt tot activering van intracellulaire signaalroutes en vervolgens, productie van een aantal verschillende inflammatoire mediatoren, met inbegrip van cytokines, chemokines en antimicrobiële peptiden. Deze Keratinocyt afkomstige eiwitten deelnemen aan de ontstekingsreactie door werven en immune cellen zoals dendritische cellen, neutrofielen en specifieke T-cellen-6,7te activeren. Omdat keratinocyten een cruciale rol in vele biologische processen spelen, was de grondgedachte achter de techniek gepresenteerd hier dus, voor het genereren van een in vitro model voor de studie van biologie van de huid. Primaire Keratinocyt culturen neonatale voorhuid verkregen worden vaak gebruikt voor het bestuderen van8,9van de biologie van de huid. Echter, met de hier beschreven techniek keratinocyten van beide geslachten zijn verkregen wat resulteert in een hogere biologische diversiteit van de cellen.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren en de generatie van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid, met inbegrip van onderhoud en de bevriezing van de keratinocyten. Het algemene doel van deze methode is het genereren van primaire menselijke keratinocyten die kan worden gebruikt als een model voor cutane biologie in vitrostudie.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven hier hoe gemakkelijk het isoleren van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid, en hoe ze in vitrocultuur. Dit model kan een globale aanvraag voor onderzoek van epidermale celbiologie, en nuttig kan zijn voor onderzoekers ook geïnteresseerd in de studie van cutane ziekten.
Enkele van de voordelen van het protocol hier beschreven is dat in tegenstelling tot de keratinocyten geïsoleerd van neonatale voorhuid verkregen van de pasgeboren mannetjes besnijdenis …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteur wil Annette Blak Rasmussen en Kristine Moeller bedanken voor hun technische ondersteuning
Materials
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | – |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | – |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | – | – | Forceps from any company can be used |
| Scissors | – | – | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | – | – | – |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | – | – | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | – |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | – |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
Referências
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. Keratinocytes as initiators of inflammation. Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A. Keratinocytes: key immunocytes of the integument. Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. The skin immune system Its cellular constituents and their interactions. Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).
- Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. Keratinocytes in inflammatory skin diseases. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).
- Gilliet, M., Lande, R. Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).
- Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes. J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).
- Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes. J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).
- Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes. Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).
- Liu, S. C., Karasek, M. Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture. J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).
- Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation. J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).
- Otkjaer, K., et al. IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms. J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).
- Watt, F. M. Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).
- Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin. Curr Protoc Cell Biol. , (2008).
- Kamsteeg, M., et al. Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent. Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).
- van den Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases. J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).
- Raaby, L., et al. Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment. Exp Dermatol. , (2017).
