代謝ラベリング
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Visão Geral
代謝ラベリングを使用して、生化学的変換とセルに発生する変更をプローブします。自然の生体分子の構造を模倣する化学類縁体を使用して、これは。セルは、類縁体の内因性の生化学的プロセスは、ラベル付けされている化合物を生産を利用します。ラベル検出および親和性の札は、SDS-PAGE や NMR などの他の生化学的分析手法を用いた代謝経路を解明するために使用することができることができます。
このビデオは、代謝ラベリングとショー 2 つの一般的な手順の概念を紹介します。 最初は、同位体標識を使用して蛋白質のリン酸化の特徴します。2 番目のカバー代謝ラベリングのも 3 つのアプリケーション内でのタンパク質間相互作用を特徴付けるための光反応性ラベリング表示されます: 植物素材をラベル付け、分類の速度を測定するための RNA および初期胚の糖鎖をラベリングします。
代謝ラベリングを使用して、セルの機械を調査します。これは生化学的変換と発生する変更をプローブする化学類縁体を使って実現されます。このビデオは、同位体およびプロシージャ、およびいくつかのアプリケーションをラベリング光反応性代謝ラベリング、一般的な原則が表示されます。
代謝ラベリングは、さまざまな方法を使用して実施できます。ここで同位体、光反応性、およびバイオ直交のラベル付けについて説明します。
自然相手のこと化学的に同一構造の類似を使用して実行は同位体標識しますですが、珍しい同位体組み込まれている構造。この L-リジン アナログ炭素・窒素原子、炭素 13、窒素 15 に置き換えられます。同位体の類縁体の存在下で培養した細胞は、その生化学的構造にそれらを組み込む予定します。代謝産物は細胞から収集および分析のための精製します。安定同位体のサンプルを分析するには、質量分析法や核磁気共鳴分光法などの技術を使用しています。放射性ラベルとサンプル同位体ラベリング プロトコルで示される液体のシンチレーション カウントと x 線フィルムを用いています。
光反応性ラベルは、紫外線にさらされるまで安定なタンパク質に組み込む機能グループです。機能グループは、最も近い蛋白質に結合する反応性官能基を形成します。一般的な例では、L-写真-ロイシン, 光反応性架橋剤の光反応基ジアジリン リングが含まれています。同位体ラベリングと対照をなして光反応性化学類縁体と自然相手のいくつかの化学類似があります。細胞は優先的に類縁体の天然化合物を組み込むことができます。したがって、模倣されている化合物の中で光反応性ラベリングを行うことが重要です。紫外線にさらされ、一度分類された蛋白質の光反応性グループ不安定になり、反応性の高いタンパク質の複雑な作成の原因に相互作用の蛋白質と相互リンク。架橋複合体は、SDS-PAGE と質量分析法を使用して、分析することができますスナップショットとして機能します。これはどんな反応が反応種を識別することによって代謝経路で発生しているし、の結合部位を決定することでやり取りする方法に洞察力を提供します。
Bioorthogonal ラベリング戦略は、自然な生体分子がほとんどない反応性を持つ小型の官能基を持つ類縁体を利用します。たとえば、アザイドと言われてその反応の生化学的反応に直交する、小規模の機能グループです。シュタウディンガー結紮のホスフィン グループのアジドフェニル グループを攻撃します。これは近くのエステル、アミン結合リガンドの結果と分子反応遷移状態を得られます。Bioorthogonal 機能グループ分子に組み込まれては蛍光官能など検出タグで結紮することができ、親和性抗原などタグします。
いくつかの概念および新陳代謝の戦略が議論されている今、研究室では、プロセスを見てみましょう。
代謝標識実験の最初のステップは興味の蛋白質を集めることです。これを行うには、セル、プレート、育つ、表現方法は目的タンパク質の合成を促進するために使用されます。この例では、ロイシン豊富な繰り返しキナーゼまたはニラで表現されます。リン酸、放射性リン-32 を含む、アナログとして使用されます。電離放射線に対する保護するために適切な対策が必要です。これには、作業領域の設定、適切な保護具を身に着けている、放射能汚染のチェックが含まれます。安全対策が実行されると、同位体の類縁化合物を含む培地が用意しています。文化からメディアを削除、1 つを含む同位体化学類縁体に置き換えされ、培養します。次の培養細胞が分離します。ライセートの収集し、精製します。
浄化後、蛋白質は SDS ページを使用し、PVDF 膜に転送が解決されます。オートラジオグラフィーは、フィルムを x 線に膜を公開することによってされるので、蛍光イメージャを使用して測定します。西部にしみが付くこと、PVDF 膜のタンパク質の相対レベルを測定するために使用されます。この例ではロイシン豊富なリン酸化レベルは、キナーゼは、293 t 細胞を測定した合成を繰り返します。どのくらいリン ゲノムスキャニング ショーは、蛋白質に組み込まれました。ニラの蛋白質のレベルを解明西部にしみが付くこと。画像解析ソフトを使用して、蛋白質のリン酸化レベルの定量的なデータを取得します。
この次の手順では、光反応性のラベルに示します。最初に、セルを準備して培養します。光反応性アナログ中間ログ段階でセルに追加し、培養します。この手順では、p benzoylphenylalanine が使用されます。サンプル間隔で収集、氷の上に置きます。サンプルは、時間の経過とともに生化学プロセスのスナップショットを取得する公開されます。興味の蛋白質は、精製し、SDS-PAGE を使用して解決します。
光反応性ラベリング戦略は興味の蛋白質と相互作用する化合物を識別するために使用されました。ウエスタンブロット高分子量蛋白質を示すショー タンパク質バンドとバイオアセッテイ照射試料に存在しています。これら紫外線照射時に発生する蛋白質蛋白質の相互作用により架橋からです。
代謝ラベリング手順を確認しましたところ、今、いくつかのプロセスを使用する方法を見てみましょう。
代謝ラベリングの概念は、多細胞生物に拡張できます。植物は作り出されたラベルの付いた植物材料に安定同位体の豊富な密封された環境で育ちます。炭素 13 を含んでいる炭酸ガスは、窒素 15 の豊富な肥料を使用しながら、筐体に追加されます。結果収穫された植物材料は炭素・窒素循環の生態系からの質問に答えることができます。
ラベルは、古い RNA から新たに合成された RNA を分離をできます。アナログの初期濃度を変更すると、新しい RNA 合成の速度を決定できます。結果は、4 thiouridine の濃度がどのくらい新しい RNA の転写に影響を示します。さらに、分光光度計で直接 RNA にラベルの混入率を定量化することができます。
双直交クリックケミストリーを用いたゼブラフィッシュ胚の糖鎖がラベル付けできます。卵は、糖のアルキン ラベルでラベリング化合物が注入されます。幼虫の糖鎖が次に縛られる色素化合物に必要な開発段階で。胚の糖鎖はイメージします。異なる時点で生成される糖鎖は、胚の開発のさまざまな段階でさまざまな色を使用したラベリングによって識別できます。
代謝ラベリング ゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオ代謝ラベリングの概念と戦略を説明、2 つの一般的な手順を行って、技術の用途のいくつかをカバーします。
見てくれてありがとう!
Procedimento
Declarações
Transcrição
Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.
Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.
Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.
Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.
Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.
Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let’s look at the process in the laboratory.
The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.
After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.
In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.
A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.
Now that we’ve reviewed metabolic labeling procedures, let’s look at some of the ways the process is used.
Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.
Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.
Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.
You’ve just watched JoVE’s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
