Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele aufzudecken, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern, speziell Rhabodvirus und Vaccinia-Virus-Therapie, aber es kann leicht an andere onkolytische angepasst werden Virus-Plattformen oder für die Entdeckung von Host-Gene, die Replikation des Virus in der Regel zu modulieren.
Abstract
Hochdurchsatz-Screening-Technologie genomweiten RNAi (RNA-Interferenz) hat am meisten benutzt, für die Entdeckung von Host-Faktoren, die Replikation des Virus auswirken. Hier präsentieren wir die Anwendung dieser Technologie zur Aufdeckung Host-Ziele, die die Vermehrung des Virus Maraba, onkolytische Rhabdovirus und Vaccinia-Virus mit dem Ziel der Verbesserung der Therapie gezielt modulieren. Während das Protokoll für die Verwendung mit onkolytische Maraba und onkolytische Vaccinia-Virus getestet wurde, dieser Ansatz gilt für andere onkolytische Viren und kann auch zur Identifizierung von Host-Ziele, die Virusreplikation in Säugetierzellen in modulieren genutzt werden Allgemeine. Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung und Validierung eines Assays für Hochdurchsatz-Screening der RNAi in Säugerzellen, wichtige Überlegungen und vorbereitende Schritte für die Durchführung von einem primären Hochdurchsatz-RNAi-Bildschirm und eine schrittweise Anleitung für wichtig Durchführung von einem primären Hochdurchsatz-RNAi-Bildschirm; Darüber hinaus beschreibt es im großen und ganzen die Methoden für die Durchführung von Nebenbild Validierung und tertiären Validierungsstudien. Der Vorteil von Hochdurchsatz-RNAi-Screening ist, dass es erlaubt, in einer umfangreichen und unvoreingenommene Weise, Host Faktoren zu katalogisieren, die jeden Aspekt der Virusreplikation zu modulieren, wofür man einen in-vitro- Test wie Infektiosität, entwickeln kann, platzen Größe, und Zytotoxizität. Es hat die macht, unvorhergesehene biotherapeutischen Ziele basierend auf aktuellen Erkenntnissen zu entdecken.
Introduction
Hochdurchsatz-genomweiten RNAi Screening erweist sich als ein wertvolles Instrument zur Aufdeckung biologischer Erkenntnisse in den verschiedensten Bereichen des Studiums einschließlich der Virus Biologie. In den vergangenen zehn Jahren haben sich zahlreiche Gruppen verpflichtet zellbasierte groß angelegte RNAi screening ausführlich Host Gene zu identifizieren, die Virusreplikation (bewertet in1,2,3,4 modulieren , 5 , 6 , 7). Interessanterweise wurden eine große Anzahl dieser Bildschirme in Krebszellen und mehrere mit Viren, die aktuellen onkolytische Viren einschließlich Vaccinia Virus8,9,10 kommen durchgeführt , Myxome Virus11, Herpes-Simplex-Virus12, vesikuläre Stomatitis Virus13,14und Maraba Virus15. Während die meisten dieser Studien auf Host Faktoren, die Einfluss auf einige Aspekte der Virusreplikation, zu bestimmen, und nicht auf die Identifizierung von biotherapeutischen Zielen für die Verbesserung der onkolytische Viren Therapie konzentrierte, konnte wertvolle Daten aus diesen Datensätzen in abgebaut werden diesem Zusammenhang. Es ist klar, dass das mächtige Potential Host Ziele zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern nicht voll ausgeschöpft worden.
Eine Fülle von onkolytische Viren Plattformen sind derzeit in präklinischen und klinischen Studien einschließlich Herpes simplex Virus, wirtseigenen und Vaccinia-Virus, die nachweisbaren Erfolge in klinischen Studien hatten getestet. Für die meisten dieser Plattformen haben Anstrengungen gerichtet in Richtung verändern das Virus-Genom, Therapie zu verbessern. Zum Beispiel um Tumor-Spezifität zu erhöhen, wurden bestimmte Viren Gene gelöscht oder mutiert zur Virusreplikation in normalen Zellen, aber nicht in Tumorzellen erheblich einschränken. In einigen Fällen transgene hinzugekommen wie GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor), die Immunantwort zu potenzieren oder NIS (Natrium-Iodid-Symporter) in Vivo Bildgebung und zelluläre Radioiodide Aufnahme aktivieren für therapeutische Zwecke verwendet werden. Allerdings gab es sehr wenig Arbeit konzentrierte sich auf Host/Tumor-Gene zu manipulieren und Untersuchung der Auswirkungen von Host/Tumor-Gene auf die onkolytische Viren Replikation. Mit dem Aufkommen von Hochdurchsatz-Screening-Technologie, es ist nun möglich, Host-Virus Interaktionen im Maßstab des Genoms zu erforschen und zu entschlüsseln, Möglichkeiten zu manipulieren das Wirtsgenom um onkolytische Viren Therapie zu verbessern (überprüft in16, 17,18).
Wir berichteten das erste Studie zeigt Proof-of-Concept für die Verwendung von Hochdurchsatz-genetisches screening um Host Ziele zu identifizieren, die manipuliert werden könnte, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern. Um Host Gene zu entdecken, die modulieren, Maraba Virus Oncolysis, ein onkolytische Rhabdovirus derzeit getestet in Phase I und II-Studien, haben wir durchgeführt genomweiten RNAi-Screens über drei verschiedene Tumorzelllinien in zweifacher Ausfertigung mit einem SiRNA (kurze RNA stören) Bibliothek für 18.120 Gene15. Pathway Analyse der Zugriffe auf den Bildschirmen identifiziert offenbart Bereicherung der Mitglieder des ER (endoplasmatische Retikulum) Stress Reaktion Wege. Wir haben 10 Treffer innerhalb dieser Wege für die sekundäre Validierung mithilfe SiRNA mit verschiedenen targeting Sequenzen von denen auf dem primären Bildschirm. Im Rahmen der tertiären Validierung, führten wir eine Rettungs-Experiment mit IRE1α (Inositol-erfordern Enzym 1 Alpha) zu bestätigen, dass der Hit war. In Vitro und in Vivo Tests mit einem niedermolekularer Inhibitor des IRE1α führte zu dramatisch verbesserte onkolytische Wirksamkeit.
Workenhe Et al. 12 auch durchgeführt einen genomweiten RNAi-Bildschirm mit einer gepoolten Lentivirale ShRNA (kurze Hairpin RNA) Bibliothek targeting 16.056 Gene Ermittlung Host Faktoren beschränken die menschliche Herpes-Simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) mutierte KM100-vermittelten Oncolysis Brust Krebszellen. In den Primärbildschirm identifiziert sie 343 Gene den Zuschlag führen zu verstärkten Zytotoxizität KM100-infizierten Zellen über Mock-infizierten Zellen; 24 dieser Gene für die sekundäre Validierung ausgewählt. Aus den 24 Gene wurden 8 Gene auf dem sekundären Bildschirm mit einem von ihnen bestätigt wird SRSF2 (Serin/Arginin-Rich Spleißen Faktor 2) anschließend mit einer genetischen Rettungs-Experiment während der tertiären Validierung bestätigt wurde. Die Gruppe fuhr fort, um einen DNA-Topoisomerase-Hemmer chemotherapeutischen zu identifizieren, der die Phosphorylierung des SRSF2 reduziert und zeigte, dass die Kombinationsbehandlung von HSV-1 KM100 mit dieser Hemmstoff führen zu längeren Überleben der TUBO Tumor-tragenden Mäusen.
In den genannten Studien folgte ein ähnlicher Workflow. Jeder begann mit einer genomweiten RNAi Primärbildschirm gefolgt von einem sekundären Bildschirm auf eine ausgewählte Anzahl von Treffern in den Primärbildschirm identifiziert. Dies wurde gefolgt von tertiären Validierungsstudien, die bestätigt, dass der Treffer auf Ziel war durch die Durchführung genetischer Experimente in Vitro mit ultimativen Validierung durchgeführt durch die Manipulation der Ziel-gen Produkt in Vivozu retten. In diesem Artikel bieten wir zunächst ein allgemeines Protokoll für die Entwicklung und Validierung eines Hochdurchsatz-SiRNA-Screening-Assays, die umfasst die Bestimmung der optimalen Transfektion Bedingungen, Höhe des Virus und die Länge der Infektion. Wir bieten auch einem detaillierten Protokoll für die Durchführung von einem primären, einem Hochdurchsatz-SiRNA-Bildschirm sowie eine allgemeine Beschreibung des Verfahrens zur Durchführung von Nebenbild Validierung und tertiären Validierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele zu identifizieren, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern. Dies wurde erfolgreich getestet mit onkolytische Maraba und onkolytische Vaccinia Virus, aber wie bereits erwähnt, es angepasst werden kann für die Verwendung mit anderen onkolytische Viren oder andere Viren in der Regel um Host Gene zu identifizieren, die Replikation des Virus zu modulieren. Das Screening Protokoll sol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Ontario Institut für Krebsforschung, der Kanada-Stiftung für Innovation, die Ottawa Regional Cancer Foundation und der Terry Fox Research Institute unterstützt. K.J.A. wurde durch ein Vanier Canada Graduate Stipendium, ein Canadian Institute for Health Research-Master Award unterstützt und ein Ontario-Graduate-Stipendium.
Materials
| Consumables | |||
| siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
| Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
| Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
| Water | Sigma | W4502 | |
| siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
| AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
| siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
| HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
| Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
| DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
| Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
| 500 ml bottles | Corning | 430282 | |
| Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
| Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
| BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
| BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
| Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
| KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
| Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
| JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
| Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
| Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |
Referências
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