RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

Summary

여기 우리는 프로토콜 설명 높은 처리량 RNAi 심사 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 폭로를 위한, 특히 rhabodvirus 및 vaccinia 바이러스 치료, 하지만 그것은 다른 oncolytic 쉽게 적용할 수 있습니다 바이러스 플랫폼 또는 변조 바이러스 복제를 일반적으로 호스트 유전자 발견.

Abstract

높은 처리량 게놈 넓은 RNAi (RNA 간섭) 심사 기술 바이러스 복제에 영향을 주는 호스트 요소를 발견 하기 위해 널리 사용 되었습니다. 여기 우리는 특별히 치료를 향상의 목표와 라바 바이러스는 oncolytic rhabdovirus, vaccinia 바이러스의 복제를 조절 하는 잠복 호스트 대상에이 기술의 응용 프로그램을 제시. 이 방법은 다른 oncolytic 바이러스에 적용 이며 또한 포유류 세포에 있는 바이러스 복제를 조절 하는 호스트 대상 식별 하는 데 이용 될 수 있다 사용 oncolytic 라바 바이러스와 oncolytic vaccinia 바이러스에 대 한 프로토콜 테스트 하는 동안 일반. 이 프로토콜 개발 및 포유류 세포, 주요 고려 사항 및 기본 높은 처리량 RNAi 스크린, 그리고에 대 한 단계별 가이드를 실시 하기 위한 중요 한 준비 단계에서 높은 처리량 RNAi 심사에 대 한 분석 결과의 유효성 검사에 설명 합니다. 실시 하는 주 높은 처리량 RNAi 스크린; 또한, 그것은 광범위 하 게 보조 화면 유효성 검사와 3 차 검증 연구를 수행 하기 위한 방법을 설명 합니다. 검사는 광범위 하 고 편견 패션, 바이러스 복제를 하나 infectivity, 등 생체 외에서 시험을 개발할 수 있습니다의 모든 측면을 변조 호스트 요소에에서 카탈로그를 하나 수 있다는 높은 처리량 RNAi의 혜택 버스트 크기, 그리고 세포 독성입니다. 그것은 biotherapeutic 대상 외 현재 지식 기반을 밝히기 힘이 있다.

Introduction

높은 처리량 게놈 넓은 RNAi 심사 공개 연구 바이러스 생물학 등의 다양 한 분야에서 생물 학적 통찰력을 위한 도구로 입증 되었습니다. 지난 십년 동안 수많은 그룹 인데요 셀 기반 대규모 RNAi 심사 광범위 하 게 변조 바이러스 복제 (^,12,3,4 검토 됨 호스트 유전자를 식별 하 ^{, 5 , 6 , 7}). 흥미롭게도, 이러한 스크린 수가 많은 암 세포와 바이러스에 현재 oncolytic 바이러스 vaccinia 바이러스^{8,9,10 포함 하 여 여러 실시 되었습니다} , Myxoma 바이러스¹¹, 포진 심 플렉스 바이러스¹², vesicular 구내 염 바이러스^13,14및 마 라바 바이러스¹⁵. 이러한 연구의 대부분의 초점은 바이러스 복제의 일부 측면에 영향을 주는 호스트 요소 식별에 그리고 oncolytic 바이러스 치료 향상을 위한 biotherapeutic 목표 식별에 동안, 귀중 한 데이터에 이러한 데이터 세트에서 채굴 수 있습니다. 이 관계. 그것은 분명 그 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 식별 하는 강력한 잠재력 하지 완전히 악용 되어.

Oncolytic 바이러스 플랫폼의 과다는 현재 단계의 임상 시험 될지도 성공 했다는 헤 르 페 스 단순 바이러스 reovirus, vaccinia 바이러스를 포함 하 여 전 임상 및 임상 연구에서 테스트 되 고 있습니다. 이러한 플랫폼의 대부분에 대 한 노력 강화 치료를 변경 바이러스 게놈 향해 감독 되었습니다. 예를 들어, 종양 특이성을 증가, 특정 바이러스 유전자가 되었습니다 삭제 하거나 크게 정상 세포, 종양 세포에만 바이러스의 복제를 제한 하려면 변경 합니다. 경우에 따라 transgenes 추가 되었습니다 GM-CSF (granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자) 면역 응답 약효를 또는 NIS (나트륨 요오드 화물 symporter) 에서 생체 내 이미징 및 세포 radioiodide 통풍 관 같은 치료 용도입니다. 그러나, 아주 작은 작업 호스트/종양 유전자를 조작 하 고 호스트/종양 유전자 oncolytic 바이러스 복제에의 영향을 탐구에 집중 되었습니다. 높은 처리량 검열 기술의 도래와 함께 그것은 지금 게놈 규모에 주인 바이러스 상호 작용을 조사 하 고 호스트 게놈 oncolytic 바이러스 치료 향상을 조작 하는 기회를 해독 가능 (^16, 에서 ^17,18).

우리는 첫 번째 연구 설명-의 증거-개념 높 처리량 유전자 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 대상 호스트를 식별 하기 위해 심사를 사용 하 여에 대 한 보고. 라바 바이러스 oncolysis, 현재 단계에서 테스트 중인 oncolytic rhabdovirus 변조 호스트 유전자를 I 및 II 시험, 우리 게놈 넓은 RNAi 스크린에 걸쳐 실시는 siRNA (짧은 방해 RNA)와 중복에서 3 다른 종양 세포 라인 18,120 유전자¹⁵를 대상으로 하는 라이브러리. 조회 화면에서 확인 된 경로 분석 응급실 (바인딩과 그물) 스트레스 응답 경로 구성원의 농축을 밝혔다. 우리는 그 기본 화면에서 다른 대상 시퀀스와 siRNA를 사용 하 여 보조 유효성 검사에 대 한 이러한 경로 내에서 10 안타를 선택. 3 차 유효성 검사의 일환으로, 우리는 IRE1α와 구조 실험을 실시 (inositol 필요한 효소 1 알파)를 대상에 적중 되었는지 확인. 생체 외에서 그리고 vivo에서 IRE1α의 작은 분자 억제 물을 사용 하 여 테스트 결과 극적으로 향상 된 oncolytic 효능.

Workenhe 외. ¹² 또한 실시 풀링된 lentiviral shRNA (짧은 헤어핀 RNA)를 사용 하 여 게놈 넓은 RNAi 스크린 인간 포진 심 플렉스 바이러스 제한 호스트 요소를 식별 하는 16,056 유전자를 대상으로 하는 라이브러리 타입 1 (HSV-1) 돌연변이 KM100 중재 oncolysis의 유 방 암 세포입니다. 기본 화면에서 그들은 343 유전자 모의 감염 세포; 이상 KM100 감염 세포의 향상 된 세포 독성 이어질의 최저 확인 그들은 선택 보조 유효성 검사에 대 한 이러한 유전자의 24. 24 유전자 중 8 유전자는 그들 중 하나는 보조 화면에서 확인 되었다 SRSF2 (2 요소 떠들고/아르기닌 풍부한 접합) 이후 3 차 유효성 검사 중 유전 구조 실험을 사용 하 여 확인 했다 되 고. 그룹의 식별을 DNA topoisomerase 억제제 화학요법 SRSF2의 인 산화를 감소를 보여주었다 TUBO 종양 방위 쥐의 확장된 생존에이 억제제 리드와 함께 HSV-1 KM100의 조합 치료에 갔다.

앞서 언급 한 연구에서 비슷한 워크플로 뒤를 이었다. 각 보조 화면 기본 화면에서 확인 하는 조회 수의 선택 수에 따라 기본 게놈 넓은 RNAi 스크린으로 시작 했다. 이 히트 대상에 했다는 포함 3 차 검증 연구에 의해 그 뒤를 이었다 유전 수행 하 여 대상 유전자 제품 비보를 조작 하 여 수행 하는 궁극적인 유효성 검사 실험 체 외에 구조. 이 문서에서는, 우리는 먼저 개발 및 최적의 transfection 조건, 바이러스, 및 감염의 길이 결정 하는 포함 한다 높은 처리량 siRNA 심사 분석 결과의 유효성 검사에 대 한 일반적인 프로토콜 제공. 높은 처리량 siRNA 화면으로 보조 화면 유효성 검사와 3 차 유효성 검사를 수행 하기 위한 방법에 대 한 전반적인 설명을 우리는 또한 주를 실시 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

Protocol

1. 개발 및 분석 결과 심사 하는 높은 처리량 siRNA의 유효성 검사 참고: 모든 실험, Hepes 버퍼링 성장 미디어 각 셀 라인에 대 한 적절 한 사용 합니다. 3 차 검증 분석 결과 최적화에서 워크플로 개요 그림 1 을 참조 하십시오. 최적의 transfection 조건의 결정 종양 세포 선을 선택 또는 이상적으로 여러 종양 세포 transfection 조건 (?…

Representative Results

워크플로 호스트 oncolytic 바이러스 치료를 향상 시키기 위해 목표를 식별 하는 데에 대 한 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 중요 한 첫 번째 단계는 높은 처리량 RNAi 스크린 실시 분석 결과 개발입니다. 그림 2A transfection 최적화 분석 결과 ?…

Discussion

여기 선물이 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 식별 하기 위해 높은 처리량 RNAi 심사 위한 프로토콜. 이 성공적으로 oncolytic 라바 바이러스와 oncolytic vaccinia 바이러스, 테스트 되었습니다 하지만, 앞에서 언급 했 듯이, 그것은 적응 시킬 수 있다 다른 oncolytic 바이러스 또는 다른 바이러스와 함께 사용 하기 위해 일반적으로 바이러스 복제를 조절 하는 유전자를 호?…

Materials

Consumables
siRNA library	GE Dharmacon	G-005005-02
Corning 384-well plate	Corning	3985
Falcon 384-well plate	Becton Dickinson	353962
Water	Sigma	W4502
siGenome SMARTpool PLK1	GE Dharmacon	M-003290-01
AllStars Negative Control siRNA	Qiagen	SI03650318
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2	GE Dharmacon	D-001206-14-20
DMEM/HIGH Glucose	GE Healthcare Life Sciences	SH30022.01
Fetal Bovine Serum	Sigma	F15051-500ML
HEPES solution (1M)	Sigma	H3535-100ML
Penicillin-Streptomycin 100X solution	GE Healthcare Life Sciences	SV30010
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	2500056
DPBS/Modified	GE Healthcare Life Sciences	SH30028.02
Lipofectamine RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778100
Oligofectamine	Thermo Fisher Scientific	1225011
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	22600-050
Resazurin sodium salt	Sigma	R7017-5G
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H21492
Formaldehyde (37% by weight)	Fisher Scientific	F79-4
500 ml bottles	Corning	430282
Adhesive Sealing Film For Microplates	Excel Scientific	361006007
Peelable Heat Sealing Foil	Thermo Fisher Scientific	AB-3720
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette	Fisher Scientific	11-120-625
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
MicroFlo Select (liquid dispenser)	Fisher Scientific	11120621
BioTek Synergy HT plate reader	Biotek	N/A
Opera Imaging and Analysis Instrument	PerkinElmer	HH10000115
KiNEDx Robotic Arm	Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)	KX-300-660
Cytomat 24C Series Automated Incubator	Thermo Fisher Scientific	50080227
JANUS Automated Workstation	PerkinElmer	AJI4M01
Plate Carousel	Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)	N/A
Alps 3000 plate sealer	Thermo Fisher Scientific	AB-3000