Här beskriver vi ett protokoll för att anställa hög genomströmning RNAi screening att avslöja värd mål som kan manipuleras för att förbättra onkolytisk virus behandling, särskilt rhabodvirus och vaccinia virus terapi, men det kan lätt anpassas till andra onkolytisk virus-plattformar eller för att upptäcka värd gener som modulera virusreplikation generellt.
Hög genomströmning genome-wide RNAi (RNA-interferens) screening teknik har använts för att upptäcka värd faktorer som påverkar virusreplikation. Här presenterar vi tillämpningen av denna teknik avtäckning värd mål som modulerar replikering av Maraba virus, onkolytisk rhabdovirus och vacciniavirus med målet att förbättra terapi. Medan protokollet har testats för användning med onkolytisk Maraba och onkolytisk vacciniavirus, denna metod är tillämplig på andra onkolytisk virus och kan också användas för att identifiera värd mål som modulerar virusreplikation i däggdjursceller i Allmänt. Det här protokollet beskriver utveckling och validering av ett test för hög genomströmning RNAi screening i däggdjursceller, viktiga överväganden och förberedelser som är viktiga för att bedriva en primär hög genomströmning RNAi skärm och en stegvis guide för genomföra en primär hög genomströmning RNAi skärm; Dessutom beskrivs det i stort sett metoderna för att genomföra sekundär skärm validering och tertiär valideringsstudier. Fördelen med hög genomströmning RNAi screening är att det tillåter en att katalogisera, i en omfattande och förutsättningslös mode, värd faktorer som modulerar någon aspekt av virusreplikation som man kan utveckla ett in vitro- test såsom smittsamhet, brast storlek, och cytotoxicitet. Det har befogenhet att avslöja bioterapeutiska mål oförutsedda baserat på nuvarande kunskap.
Hög genomströmning genome-wide RNAi screening har visat sig vara ett ovärderligt verktyg för att avslöja biologisk insikter inom skilda områden av studien inklusive virus biologi. Under det senaste decenniet eller så, många grupper har åtagit sig cellbaserade storskaliga RNAi screening för att i stor utsträckning identifiera värd gener som modulerar virusreplikation (granskad i1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). intressant, ett stort antal av dessa skärmar har utförts i cancerceller och flera med virus som är nuvarande onkolytisk virus kandidater inklusive vaccinia virus8,9,10 , Myxoma, som producerats virus11, herpes simplex virus12, vesikulär stomatit virus13,14och Maraba virus15. Medan fokus för flesta av dessa studier var att identifiera värd faktorer som påverkar vissa aspekter av virusreplikation och inte identifiera bioterapeutiska mål för att förbättra onkolytisk virus terapi, kan värdefulla data brytas från dessa datamängder i detta avseende. Det är tydligt att kraftfulla potential att identifiera värd mål som kan manipuleras för att förbättra onkolytisk virus behandling inte har utnyttjats fullt ut.
En uppsjö av onkolytisk virus plattformar testas för närvarande i prekliniska och kliniska studier inklusive herpes simplex virus, reovirus och vaccinia virus, som har haft påvisbar framgång i sent stadium kliniska prövningar. För flesta av dessa plattformar, har insatser riktats mot att förändra virus genomen att förbättra behandling. Exempelvis för att öka tumör specificitet, har specifikt virus gener raderats eller muterade för att avsevärt begränsa virusreplikation i normala celler, men inte i tumörceller. I vissa fall transgener har lagts till som GM-CSF (granulocyt makrofag granulocytkolonistimulerande faktor) att förstärka immunsvaret eller NIS (natrium jodid symporter) att aktivera i vivo imaging och cellulär radioiodide upptag för terapeutiska ändamål. Det har dock varit mycket lite arbete inriktat på att manipulera värd/tumör gener och utforskar inverkan värd/tumör gener på onkolytisk virusreplikation. Med tillkomsten av high-throughput screening teknik, är det nu möjligt att probe värd-virus interaktioner i genomet skala och dechiffrera möjligheter att manipulera värd genomet för att förbättra onkolytisk virus behandling (recenserade i16, 17,18).
Vi rapporterade den första studien visar proof-of-concept för att använda hög genomströmning genetisk screening för att identifiera värd mål som kan manipuleras för att förbättra onkolytisk virus behandling. För att upptäcka värd gener som modulerar Maraba virus oncolysis, en onkolytisk rhabdovirus för närvarande testas i fas I och II-studier, genomförde vi genome-wide RNAi skärmar över tre olika tumör cellinjer i två exemplar med en siRNA (kort störande RNA) biblioteket riktar sig 18,120 gener15. Väg analys av hits som identifierats i skärmarna avslöjade anrikning av medlemmar av ER (endoplasmatiska retiklet) stress svar vägar. Vi valt ut 10 träffar inom dessa vägar för sekundära validering med siRNA med olika inriktning sekvenser från de av den primära skärmen. Som en del av tertiär validering, vi har utfört en räddning experiment med IRE1α (inositol-kräver enzymet 1 alpha) för att bekräfta att träffen var på målet. In vitro och i vivo tester med en liten molekyl hämmare av IRE1α resulterade i dramatiskt förbättrad onkolytisk effekt.
Workenhe et al. 12 genomförde också en genome-wide RNAi-skärm som använder en poolad lentiviral shRNA (kort hårnål RNA) bibliotek inriktning 16,056 gener för att identifiera värd faktorer begränsar människors herpes simplex virus typ 1 (HSV-1) mutant KM100-medierad oncolysis av bröst cancerceller. I den primära skärmen identifierade de 343 gener överväldigande som leder till förbättrad cytotoxiciteten hos KM100-infekterade celler över mock-infekterade celler; de utvalda 24 av dessa gener för sekundära validering. Av de 24 generna, 8 gener bekräftades i den sekundära skärmen med en av dem är SRSF2 (serin/arginin-rika skarvning faktor 2) vilket bekräftades därefter med en genetisk räddning experiment under tertiär validering. Gruppen fortsatte med för att identifiera en DNA topoisomeras hämmare kemoterapeutiska som minskar fosforyleringen av SRSF2 och visade att kombinationsbehandling av HSV-1 KM100 med denna hämmare leda till förlängd överlevnad av TUBO tumör-bärande möss.
I ovan nämnda studier följdes ett liknande arbetsflöde. Varje började med en primär genome-wide RNAi skärmen följt av en sekundär skärm på ett utvalt antal träffar som identifierats i den primära skärmen. Detta följdes av tertiär valideringsstudier, vilket inkluderade bekräftar att träffen var på målet genom att utföra genetiska rädda experiment in vitro med ultimate validering utförs genom att manipulera mål genen produkt i vivo. I den här artikeln ger vi först en allmän protokoll för utveckling och validering av en hög genomströmning siRNA-screening test, vilket innebär att fastställa optimala transfection villkoren, mängd virus, och längden på infektion. Vi erbjuder också ett detaljerat protokoll för att bedriva en primär en hög genomströmning siRNA skärm samt en övergripande beskrivning av metoden för att utföra sekundär skärm validering och tertiär validering.
Här presenterar vi ett protokoll för att anställa hög genomströmning RNAi screening identifiera värd mål som kan manipuleras för att förbättra onkolytisk virus behandling. Detta har testats framgångsrikt med onkolytisk Maraba och onkolytisk vacciniavirus, men, som nämnts, det kan anpassas för användning med andra onkolytisk virus eller andra virus allmänt för att identifiera värd gener som modulerar virusreplikation. Screening protokoll är också utformad för att identifiera gener som kan öka eller mi…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidrag från Ontario Institute för cancerforskning, Stiftelsen Kanada för Innovation, Stiftelsen Ottawa regionala Cancer och Terry Fox Research Institute. K.J.A. stöddes av Vanier Kanada Graduate stipendium, en kanadensisk Institute for Health Research-Master’s Award, och en Ontario Graduate stipendium.
Consumables | |||
siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
Water | Sigma | W4502 | |
siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
500 ml bottles | Corning | 430282 | |
Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |