Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes
Summary
Complexidade dos sistemas na vivo torna difícil distinguir entre a ativação e a inibição do receptor do entalhe por trans– e cis-ligantes, respectivamente. Aqui, apresentamos um protocolo baseado em vitro ensaios de agregação de célula para avaliação qualitativa e semi-quantitativa da vinculação de entalhe de Drosophila Trans-ligantes vs cis-ligantes.
Abstract
Entalhe de sinalização é um sistema de comunicação célula-célula evolutivamente conservada usado amplamente no desenvolvimento animal e manutenção de adulta. Interação do receptor Notch com ligantes de vizinhas células induz a ativação da via de sinalização (trans-ativação), enquanto a interação com ligantes da mesma célula inibe a sinalização (cis-inibição). Equilíbrio adequado entre trans-ativação e cis-inibição ajuda a estabelecer os níveis ideais de entalhe sinalização em alguns contextos durante o desenvolvimento do animal. Por causa dos domínios de expressão sobreposição de entalhe e seus ligantes em muitos tipos de células e a existência de mecanismos de feedback, estudando os efeitos de uma determinada modificação pós-traducional na trans– contra cis-interações de entalhe e seus ligantes na vivo é difícil. Aqui, descrevemos um protocolo para o uso de células de Drosophila S2 em célula-agregação ensaios para avaliar os efeitos de derrubar um modificador de via Notch na ligação de entalhe para cada ligante trans e cis. Células S2 estàvel ou transitoriamente transfectadas com um vetor de entalhe-expressando são misturadas com células expressando cada ligante de entalhe (S2-Delta ou S2-Serrate). Trans-ligação entre o receptor e ligantes resulta na formação de agregados de células heterotypic e é medido em termos de número de agregados por mL, composto de > 6 células. Para examinar o efeito inibitório do cis-ligantes, S2 células expressando co entalhe e cada ligante são misturadas com células S2-Delta ou S2-Serrate e o número de agregados é quantificado como descrito acima. A diminuição relativa do número de agregados devido à presença de cis-ligantes fornece uma medida de cis-ligand-mediados por inibição da trans-ligação. Estes ensaios simples podem fornecer dados semi quantitativos sobre os efeitos de manipulações genéticas ou farmacológicos na ligação de entalhe para seus ligantes e podem ajudar a decifrar os mecanismos moleculares subjacentes os efeitos na vivo de tais manipulações na sinalização Notch.
Introduction
Canônico de sinalização Notch é um mecanismo de comunicação de curto alcance de célula para célula que exige contato físico dos vizinhos células para facilitar a interação entre receptores Notch e seus ligantes1. Interação do receptor do entalhe (presente na superfície das células do sinal de recepção) com ligantes (presentes na superfície de sinal-enviando células) inicia sinalização Notch e é conhecida como trans-ativação2. Por outro lado, a interação entre entalhe e seus ligantes na mesma cela leva à inibição da via de entalhe de e é conhecida como cis-inibição3. O equilíbrio entre trans– e cis-interações é necessária para garantir o ideal Notch ligante-dependentes, sinalização4. Drosófila tem um receptor do entalhe e dois ligantes (Delta e Serrate) ao contrário de mamíferos, que têm quatro receptores Notch e cinco ligantes [irregulares 1 (JAG1), JAG2, delta-like 1 (DLL1), DLL3 e DLL4]5. Tendo esta simplicidade, o modelo de Drosophila oferece a facilidade para dissecar/estudo os efeitos dos modificadores de percurso em interações de entalhe-ligante e, posteriormente, na sinalização Notch. Em determinados contextos durante o desenvolvimento animal (incluindo desenvolvimento de asa em drosófila), ambos de cis– e trans-interações envolvidas para alcançar a sinalização adequada do entalhe e célula de destino1,6 . É importante distinguir os efeitos dos modificadores de via Notch nestes contextos na cis– e trans-interações de entalhe com seus ligantes.
Nosso grupo relatado anteriormente que a adição de um resíduo de hidrato de carbono chamado xilose de Drosophila entalhe negativamente regula entalhe sinalização em determinados contextos, incluindo asa desenvolvimento7. Perda de Souza (a enzima que xylosylates entalhe) leva a um fenótipo de “perda da veia da asa”7. Mais recentemente, experimentos de dosagem de gene e clonal análise foram utilizados para mostrar que perda de Souza realça recordando, mediada por Delta entalhe. Para distinguir se a sinalização reforçada de entalhe em mutantes de Souza é um resultado da diminuição da cis-inibição ou aumento trans-ativação, estudos de gravidez ectópica superexpressão de ligantes Notch em discos imaginária asa larval usando o driver de dpp-GAL4 foram realizadas. Estas experiências fornecidas provas sugerindo que Shams regula trans-ativação de entalhe por Delta sem afetar o entalhe cis-inibição por ligantes8. No entanto, feed-back regulamentos e efeitos de ligantes endógenos podem complicar a interpretação dos estudos de superexpressão ectópica1,6,9.
Para resolver esse problema, células de Drosophila S210 foram usados, que preveem um sistema simples em vitro entalhe-ligante interação estudos11,12. Células de S2 não express endógena do receptor do entalhe e Delta ligante11 e expressar um nível baixo de serrilhado,13, que não afeta o entalhe-ligante agregação experimentos8. Portanto, as células S2 podem estàvel ou transitoriamente transfected por entalhe e/ou ligantes individuais (Delta ou Serrate) para gerar células que expressam exclusivamente o receptor do entalhe ou um dos seus ligantes ou uma combinação deles. Mistura de células do entalhe-expressando S2 com ligante-expressando resultados de células S2 na formação de agregados heterotypic mediada pelo receptor-ligante ligação11,12,14. Quantificação da formação agregada fornece uma medida da trans-vinculação entre entalhe e seus ligantes15 (Figura 1). Da mesma forma, as células de S2 podem ser co transfectadas com ligantes Notch e Delta ou Serrate (ou seja, cis-ligantes). Cis-ligantes nestas células S2 entalhe-expressando revogar a vinculação do entalhe com trans-ligantes e resultado em diminuição da formação agregado8,12,14. A diminuição relativa na formação de agregados causada por cis-ligantes fornece uma medida do efeito inibitório do cis-ligantes na ligação entre o entalhe e trans-ligantes (Figura 2). Nesse sentido, os ensaios de agregação celular foram utilizados para examinar o efeito de perda de xylosylation trans– e cis-interações entre entalhe e seus ligantes.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para ensaios de agregação de célula objetivou avaliar a vinculação do entalhe com trans-ligantes e sua inibição pelo cis-ligantes utilizando células de Drosophila S2. Como exemplo, podemos fornecer os dados que nos permitiram determinar o efeito de entalhe xylosylation na ligação entre o entalhe e trans-Delta8. Estes ensaios simples fornecem uma avaliação semi-quantitativa do entalhe-ligante interações em vitro e ajudam a determinar os mecanismos moleculares subjacentes os efeitos na vivo de modificadores de via Notch.
Protocol
Representative Results
Discussion
Canônico de sinalização Notch depende das interacções entre o receptor do entalhe e seus ligantes5. Embora a maioria dos estudos sobre a via de Notch principalmente considerar a vinculação do entalhe e ligantes em células vizinhas (trans), entalhe e ligantes mesmo células interagem e estes so-called cis-interações podem desempenhar um papel inibitório no entalhe sinalização de3,4. Nesse sentido, para decifra…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o apoio do NIH/NIGMS (R01GM084135 de HJN) e Fundação de Mizutani para eficientemente (grant #110071 para HJN) e é grato ao Tom V. Lee para discussões e sugestões sobre os ensaios e Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine e a drosófila genômica recurso Center (DGRC) para plasmídeos e linhas celulares.
Materials
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
Referências
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