Gedeeltelijke gal Duct afbinding in de muis: een gecontroleerde Model van gelokaliseerde obstructieve cholestase
Summary
Hier presenteren we gedeeltelijke gal duct afbinding als een chirurgische model van lever schade en regeneratie van knaagdieren.
Abstract
Bij knaagdieren is volledige gal duct afbinding (cBDL) van de Galgang een gevestigde chirurgische techniek voor het bestuderen van obstructieve cholestase en gal duct proliferatie. Maar, op lange termijn experimenten kunnen leiden tot hogere morbiditeit en mortaliteit. Bij select muis stammen met onderliggende leveraandoening, kunnen zinvolle vergelijkingen worden gemaakt zelfs met Afbinding van een enkele kwab van de lever, waardoor dieren schaden en kosten kan verminderen. Hier beschrijven we gedeeltelijke gal duct afbinding (pBDL) in de muis, waarin alleen de linker hepatische koker van de gal is afgebonden, biliaire obstructie in de linker kwab, maar niet de resterende lobben veroorzaken. Met zorgvuldige microchirurgische techniek kunnen pBDL experimenten kosteneffectief, aangezien de unligated kwab als een interne controle op de ligaturen lobben, dient wanneer onderworpen aan dezelfde voorwaarden in hetzelfde dier. In tegenstelling tot cBDL is een aparte sham bediende controlegroep niet nodig. pBDL is zeer nuttig om direct vergelijken gelokaliseerd versus systemische effecten van cholestase en andere componenten van de ingehouden Gal. pBDL andere doelen kan ook worden gebruikt als een nieuwe methode te onderzoeken van de mechanismen gerelateerd aan medicijnen en cel migratie.
Introduction
Chirurgische modellen van acute lever schade en herstel, zoals gedeeltelijke hepatectomy of Galgang afbinding (cBDL), hebben gebruikt voor decennia in knaagdieren lever regeneratie en pathobiology1,2te gaan studeren. In cBDL, is de Galgang (die wegloopt alle gal in de lever wordt geproduceerd) afgebonden, resulterend in obstructieve cholestase, ontsteking en fibrose in de eerste 2-3 weken na de operatie, met eventuele progressie naar cirrose3. Gal duct proliferatie, transdifferentiatie en inductie van resident lever voorlopercellen zijn ook kenmerken van cBDL4,5. Hoewel cBDL specifieke mechanismen van obstructieve cholangiopathy, die goed gekarakteriseerd met reproduceerbare resultaten in wild-type muizen en in deze stammen met normale levers6,7,8 belicht, de procedure kan technisch veeleisende in sommige transgene muismodellen van leverziekten, vereisen meer dieren dan verwacht als gevolg van de hogere morbiditeit en mortaliteit van biliaire obstructie na verloop van tijd. Deze techniek is ook gunstig voor de studie van transgene muizen met onderliggende lever ziekte, die de stress langdurig cursus experimenten na cBDL anders niet zou kunnen tolereren.
pBDL bieden een redelijk alternatief om te helpen overwinnen sommige van deze uitdagingen. Eerste pBDL studies in wild-type muizen gericht te onderscheiden van lokaal optreden en systemische bemiddelaars van ontsteking9. In pBDL, de belangrijkste biliaire samenvloeiing van de rechter en linker hepatische galwegen boven de Galgang is zorgvuldig gevisualiseerd op de Hilus en alleen de linker hepatische koker van de gal is afgebonden voor het genereren van een gelokaliseerde obstructieve cholestase. pBDL biedt verschillende voordelen aan het cBDL. In pBDL fungeert de unligated rechter kwab als een identiek gecompenseerde interne controle voor de ligaturen linker kwab, onderworpen aan dezelfde systemische effecten, zoals voedingstoestand of circulerende factoren. Hoewel systemische pro-inflammatoire mediatoren aanwezig waren, Osawa et al. waargenomen minder fibrose en necrose in de lobben van de unligated, maar meer ontstekingscellen en transformerende groeifactor-β expressie in de ligaturen kwab9.
Meer recentelijk, pBDL heeft is opnieuw gedefinieerd om te studeren lever parenchymal effecten van ingehouden gal10. Met behulp van hetzelfde dier voor interne controle (unligated “sham”) en experimentele groepen, helften pBDL effectief het aantal dieren per experiment, dat op zijn beurt rendabeler is nodig. De muizen tolereren de effecten van pBDL veel beter, zodat het ideale moment cursus experimenteren (≥2 weken) kunnen worden bereikt in de ligaturen kwab. Bovenal pBDL directe Intrahepatische effecten van obstructieve cholestase kan onderscheiden en behouden van gal componenten in de ligaturen kwab, in vergelijking met de unligated controle kwab. PBDL is over het algemeen een aantrekkelijke methode kwab-specifieke effecten van gelokaliseerde cholestase in de lever te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel cBDL de meest voorkomende experimentele techniek voor obstructieve cholestase is, kan het meerdere uitdagingen presenteren in knaagdieren. Afhankelijk van het aantal postoperatieve dagen nodig om te bereiken van een eindpunt, kunnen de dieren ervaren significante morbiditeit en mortaliteit naarmate de tijd vordert. De mate van weefsel schade en biliaire necrose wordt verder verergerd wanneer u werkt met sommige transgene muismodellen van leverziekte, waaruit abnormale lever parenchym en functie op basislijn. In ve…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Khan erkent subsidie ondersteuning van NIH/NICHD K12HD052892, de Alpha–1 Stichting, de Stichting Hillman en de Pittsburgh lever Research Center. Dr. Michalopoulos erkent subsidie ondersteuning van NIH/NIDDK P01DK096990. Wij waarderen de uitstekende en genereus technische bijstand van Anne Orr. Wij zijn ook dankbaar Dr David A. Geller voor het verstrekken van toegang tot de transplantatie/knaagdier microchirurgie lab.
Materials
| Microscope-Leica Wild M650, 6–40× magnification | Leica Microsystems | n/a | |
| Tec 3 isoflurane funnel fill vaporizer | General Anesthetic Services | n/a | |
| Stevens Tenotomy Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation | ASSI.9193 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | |
| Mosquito classic delicate hemostatic forceps | Codman | 30-4472 | |
| Micro-retractor | Murdock; Roboz Surgical Instrument | RS-6550 | |
| Nonwoven gauze sponges | Fisherband | 870-PC-DBL | |
| Puritan 6” Small Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company | 868-WCS | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Straight/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-23 | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Angled 45°/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-25 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine science tools | 15000-00 | |
| Microneedle holder | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | |
| Micro AROSuture, sterile 10-0 nylon suture, 70 µm, TAP points | AROSurgical Instruments Corporation | T4A10N07 | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J662H | |
| 5-ml Syringe | BD | 309646 | |
| Falcon tissue culture dish, 60 × 15 mm | Corning | 353002 | |
| Isoflurane, United States Pharmacopeia (USP) liquid for inhalation, 250 ml | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | |
| Buprenex injectable (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496-0757-1 | |
| Cefazolin for injection , USP | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-238-61 | |
| PVP scrub solution (povidone–iodine 7.5%) | Medline | NDC 12496-0757-1 | |
| 70% Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Phosphate Buffered Saline Without Calcium or Magnesium | LONZA | 17-516F | |
| Sirius Red | Sigma | 365548 | |
| Hematolxylin | Fisher (Richard-Allan Scientific) | 22-050-111 (7211) | |
| Eosin | Anatech (Fisher) | 832 (NC9686037) | |
| Formalin | Fisher | SF100-20 |
Referências
- Higgins, G. M., Anderson, R. Experimental pathology of the liver – Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. The Journal of Pathology and Bacteriology. 35 (5), 769-798 (1932).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Michalopoulos, G. K., Barua, L., Bowen, W. C. Transdifferentiation of rat hepatocytes into biliary cells after bile duct ligation and toxic biliary injury. Hepatology. 41 (3), 535-544 (2005).
- Dipaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Guyot, C., Combe, C., Desmouliere, A. The common bile duct ligation in rat: A relevant in vivo model to study the role of mechanical stress on cell and matrix behaviour. Histochem Cell Biol. 126 (4), 517-523 (2006).
- Zhang, Y., et al. Effect of bile duct ligation on bile acid composition in mouse serum and liver. Liver Int. 32 (1), 58-69 (2012).
- Tag, C. G., et al. Bile duct ligation in mice: induction of inflammatory liver injury and fibrosis by obstructive cholestasis. J Vis Exp. (96), e52438 (2015).
- Osawa, Y., et al. Systemic mediators induce fibrogenic effects in normal liver after partial bile duct ligation. Liver Int. 26 (9), 1138-1147 (2006).
- Khan, Z., et al. Bile Duct Ligation Induces ATZ Globule Clearance in a Mouse Model of alpha-1 Antitrypsin Deficiency. Gene Expr. 17 (2), 115-127 (2017).
- Birkhead, H. A., Briggs, G. B., Saunders, L. Z. Toxicology of cefazolin in animals. J Infect Dis. 128, 378 (1973).
- Kunst, M. W., Mattie, H., van Furth, R. Antibacterial efficacy of cefazolin and cephradine in neutropenic mice. Infection. 7 (1), 30-34 (1979).
- Traul, K. A., et al. Safety studies of post-surgical buprenorphine therapy for mice. Lab Anim. 49 (2), 100-110 (2015).
- Carlson, J. A., et al. Accumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest. 83 (4), 1183-1190 (1989).
- Sifers, R. N., Finegold, M. J., Woo, S. L. Alpha-1-antitrypsin deficiency: accumulation or degradation of mutant variants within the hepatic endoplasmic reticulum. Am J Respir Cell Mol Biol. 1 (5), 341-345 (1989).
- Rudnick, D. A., Shikapwashya, O., Blomenkamp, K., Teckman, J. H. Indomethacin increases liver damage in a murine model of liver injury from alpha-1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 44 (4), 976-982 (2006).
- Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
- Glaser, S. S., Alpini, G. Activation of the cholehepatic shunt as a potential therapy for primary sclerosing cholangitis. Hepatology. 49 (6), 1795-1797 (2009).
- Gurpinar, E., et al. A novel sulindac derivative inhibits lung adenocarcinoma cell growth through suppression of Akt/mTOR signaling and induction of autophagy. Mol Cancer Ther. 12 (5), 663-674 (2013).
- Alpini, G. G., Francis, H., Marzioni, M., Venter, J., Phinizy, J., LeSage, G. . Madame Curie Bioscience Database. , (2013).
- Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J Surg Res. 164 (2), 221-227 (2010).
- Delhove, J. M., et al. Longitudinal in vivo bioimaging of hepatocyte transcription factor activity following cholestatic liver injury in mice. Sci Rep. 7, 41874 (2017).
- Li, C., et al. Homing of bone marrow mesenchymal stem cells mediated by sphingosine 1-phosphate contributes to liver fibrosis. J Hepatol. 50 (6), 1174-1183 (2009).
- Xu, J., et al. Factors released from cholestatic rat livers possibly involved in inducing bone marrow hepatic stem cell priming. Stem Cells Dev. 17 (1), 143-155 (2008).
- Sharma, S., et al. Propitious role of bone marrow-derived mononuclear cells in an experimental bile duct ligation model: potential clinical implications in obstructive cholangiopathy. Pediatr Surg Int. 29 (6), 623-632 (2013).
