Delvis galdegang ligatur i musen: et kontrolleret Model af lokaliserede obstruktiv kolestase
Summary
Vi præsenterer her, delvis galdegang ligatur som kirurgisk model af leverskade og regeneration i gnavere.
Abstract
I gnavere er komplet galdegang ligatur (cBDL) af fælles galdegang en etableret kirurgisk teknik til at studere obstruktiv kolestase og galdegang spredning. Langsigtet eksperimenter kan imidlertid føre til øget sygelighed og dødelighed. I Vælg mus stammer med underliggende leversygdom, kan meningsfulde sammenligninger foretages selv med ligering af et enkelt lap af leveren, som kan reducere dyrs tab og udgifter. Her beskriver vi delvis galdegang ligatur (pBDL) i mus, hvor kun den venstre hepatisk galdegang er forbundet, forårsager biliær obstruktion i venstre lap, men ikke de resterende fliger. Med omhyggelig microsurgical teknik, kan pBDL eksperimenter være omkostningseffektive, da den unligated lap fungerer som en intern kontrol til de sammenskrevne fliger, når de underkastes de samme betingelser i de samme dyr. I modsætning til cBDL er en separat sham-drives kontrolgruppe ikke nødvendigt. pBDL er meget nyttigt at direkte sammenligne lokaliseret versus systemiske virkninger af kolestase og andre beholdt galde komponenter. pBDL kan også være repurposed som en roman metode til at undersøge mekanismer relateret til medicin og celle migration.
Introduction
Kirurgisk modeller af akut leverskade og reparation, som delvis hepatectomy eller fælles galdegang ligatur (cBDL), har været brugt i årtier i gnavere for at studere lever regenerering og pathobiology1,2. I cBDL, er fælles galdegang (som dræner alle galde produceres i leveren) forbundet, hvilket resulterer i obstruktiv kolestase, inflammation og fibrose i de første 2-3 uger efter indgrebet, med eventuel progression til skrumpelever3. Galdegang spredning, transdifferentiation og induktion af hjemmehørende lever stamceller er også elementer i cBDL4,5. Selvom cBDL belyser bestemte mekanismer af obstruktiv cholangiopathy, som er godt præget med reproducerbare resultater i wild-type mus og i disse stammer med normal lever6,7,8, den proceduren kan være teknisk krævende i nogle transgene musemodeller af leversygdomme, der kræver flere dyr end forventet på grund af højere sygelighed og dødelighed af biliær obstruktion over tid. Denne teknik er også gavnligt for at studere Transgene mus med underliggende lever sygdom, som ikke kan tolerere, at stress i længere tid kursus forsøg efter cBDL.
pBDL kan give et fornuftigt alternativ for at hjælpe med at overvinde nogle af disse udfordringer. Indledende pBDL undersøgelser i wild-type mus til formål at skelne lokalt fungerende og systemisk mediatorer af inflammation9. I pBDL, det vigtigste biliær sammenløbet af de højre og venstre hepatisk galdegangene over fælles galdegang er omhyggeligt visualiseret på hilum, og kun den venstre hepatisk galdegang er forbundet til at generere en lokaliseret obstruktiv kolestase. pBDL giver flere fordele til cBDL. I pBDL fungerer unligated højre lobe som en identisk matchede intern kontrol for den sammenskrevne venstre lap, underkastes de samme systemiske virkninger, såsom ernæringsmæssige status eller cirkulerende faktorer. Selv om systemisk pro-inflammatoriske mediatorer var til stede, Osawa et al. observeret mindre fibrose og nekrose i de unligated fliger, men steget inflammatoriske celler og omdanne vækst faktor-β udtryk i sammenskrevne lap9.
For nylig, pBDL er blevet omdefineret til at studere lever parenkymalt effekter af beholdt galde10. Ved hjælp af de samme dyr for intern kontrol (unligated “fingeret”) og eksperimentelle grupper, halverer pBDL effektivt antallet af dyr behov pr. eksperiment, som igen er mere omkostningseffektiv. Musene tåle virkningerne af pBDL meget bedre, således at det ideelle tidspunkt kursus eksperimentere (≥2 uger) kan opnås i den sammenskrevne lap. Vigtigst, pBDL kan skelne direkte intrahepatisk virkningerne af obstruktiv kolestase og beholdt galde komponenter i den sammenskrevne lap, i forhold til unligated kontrol lap. Samlet set er pBDL en attraktiv metode til at studere lap-specifikke effekter af lokaliserede kolestase i leveren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om cBDL er den mest almindelige eksperimentel teknik til obstruktiv kolestase, kan den forelægge flere udfordringer i gnavere. Afhængigt af antallet af postoperative dage kræves for at opnå et slutpunkt, kan dyr opleve betydelig sygelighed og dødelighed som tiden skrider frem. Graden af vævsskade og galde nekrose er yderligere forværret, når du arbejder med nogle transgene musemodeller af leversygdom, som viser unormal lever parenkym og funktion på baseline. I forhold til cBDL, rapporter om pBDL er begræns…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Khan anerkender tilskud fra NIH/NICHD K12HD052892, alfa-1-Foundation, Hillman Foundation og Pittsburgh leveren Research Center. Dr. Michalopoulos anerkender tilskud fra NIH/NIDDK P01DK096990. Vi sætter pris på den fremragende og generøse teknisk bistand af Anne Orr. Vi er også taknemmelige til Dr. David A. Geller for at give adgang til transplantation/gnaver mikrokirurgi lab.
Materials
| Microscope-Leica Wild M650, 6–40× magnification | Leica Microsystems | n/a | |
| Tec 3 isoflurane funnel fill vaporizer | General Anesthetic Services | n/a | |
| Stevens Tenotomy Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation | ASSI.9193 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | |
| Mosquito classic delicate hemostatic forceps | Codman | 30-4472 | |
| Micro-retractor | Murdock; Roboz Surgical Instrument | RS-6550 | |
| Nonwoven gauze sponges | Fisherband | 870-PC-DBL | |
| Puritan 6” Small Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company | 868-WCS | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Straight/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-23 | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Angled 45°/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-25 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine science tools | 15000-00 | |
| Microneedle holder | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | |
| Micro AROSuture, sterile 10-0 nylon suture, 70 µm, TAP points | AROSurgical Instruments Corporation | T4A10N07 | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J662H | |
| 5-ml Syringe | BD | 309646 | |
| Falcon tissue culture dish, 60 × 15 mm | Corning | 353002 | |
| Isoflurane, United States Pharmacopeia (USP) liquid for inhalation, 250 ml | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | |
| Buprenex injectable (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496-0757-1 | |
| Cefazolin for injection , USP | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-238-61 | |
| PVP scrub solution (povidone–iodine 7.5%) | Medline | NDC 12496-0757-1 | |
| 70% Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Phosphate Buffered Saline Without Calcium or Magnesium | LONZA | 17-516F | |
| Sirius Red | Sigma | 365548 | |
| Hematolxylin | Fisher (Richard-Allan Scientific) | 22-050-111 (7211) | |
| Eosin | Anatech (Fisher) | 832 (NC9686037) | |
| Formalin | Fisher | SF100-20 |
Referências
- Higgins, G. M., Anderson, R. Experimental pathology of the liver – Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. The Journal of Pathology and Bacteriology. 35 (5), 769-798 (1932).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Michalopoulos, G. K., Barua, L., Bowen, W. C. Transdifferentiation of rat hepatocytes into biliary cells after bile duct ligation and toxic biliary injury. Hepatology. 41 (3), 535-544 (2005).
- Dipaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Guyot, C., Combe, C., Desmouliere, A. The common bile duct ligation in rat: A relevant in vivo model to study the role of mechanical stress on cell and matrix behaviour. Histochem Cell Biol. 126 (4), 517-523 (2006).
- Zhang, Y., et al. Effect of bile duct ligation on bile acid composition in mouse serum and liver. Liver Int. 32 (1), 58-69 (2012).
- Tag, C. G., et al. Bile duct ligation in mice: induction of inflammatory liver injury and fibrosis by obstructive cholestasis. J Vis Exp. (96), e52438 (2015).
- Osawa, Y., et al. Systemic mediators induce fibrogenic effects in normal liver after partial bile duct ligation. Liver Int. 26 (9), 1138-1147 (2006).
- Khan, Z., et al. Bile Duct Ligation Induces ATZ Globule Clearance in a Mouse Model of alpha-1 Antitrypsin Deficiency. Gene Expr. 17 (2), 115-127 (2017).
- Birkhead, H. A., Briggs, G. B., Saunders, L. Z. Toxicology of cefazolin in animals. J Infect Dis. 128, 378 (1973).
- Kunst, M. W., Mattie, H., van Furth, R. Antibacterial efficacy of cefazolin and cephradine in neutropenic mice. Infection. 7 (1), 30-34 (1979).
- Traul, K. A., et al. Safety studies of post-surgical buprenorphine therapy for mice. Lab Anim. 49 (2), 100-110 (2015).
- Carlson, J. A., et al. Accumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest. 83 (4), 1183-1190 (1989).
- Sifers, R. N., Finegold, M. J., Woo, S. L. Alpha-1-antitrypsin deficiency: accumulation or degradation of mutant variants within the hepatic endoplasmic reticulum. Am J Respir Cell Mol Biol. 1 (5), 341-345 (1989).
- Rudnick, D. A., Shikapwashya, O., Blomenkamp, K., Teckman, J. H. Indomethacin increases liver damage in a murine model of liver injury from alpha-1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 44 (4), 976-982 (2006).
- Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
- Glaser, S. S., Alpini, G. Activation of the cholehepatic shunt as a potential therapy for primary sclerosing cholangitis. Hepatology. 49 (6), 1795-1797 (2009).
- Gurpinar, E., et al. A novel sulindac derivative inhibits lung adenocarcinoma cell growth through suppression of Akt/mTOR signaling and induction of autophagy. Mol Cancer Ther. 12 (5), 663-674 (2013).
- Alpini, G. G., Francis, H., Marzioni, M., Venter, J., Phinizy, J., LeSage, G. . Madame Curie Bioscience Database. , (2013).
- Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J Surg Res. 164 (2), 221-227 (2010).
- Delhove, J. M., et al. Longitudinal in vivo bioimaging of hepatocyte transcription factor activity following cholestatic liver injury in mice. Sci Rep. 7, 41874 (2017).
- Li, C., et al. Homing of bone marrow mesenchymal stem cells mediated by sphingosine 1-phosphate contributes to liver fibrosis. J Hepatol. 50 (6), 1174-1183 (2009).
- Xu, J., et al. Factors released from cholestatic rat livers possibly involved in inducing bone marrow hepatic stem cell priming. Stem Cells Dev. 17 (1), 143-155 (2008).
- Sharma, S., et al. Propitious role of bone marrow-derived mononuclear cells in an experimental bile duct ligation model: potential clinical implications in obstructive cholangiopathy. Pediatr Surg Int. 29 (6), 623-632 (2013).
