Partiell gallgången Ligation i musen: en kontrollerad modell av lokaliserade obstruktiv kolestas
Summary
Här presenterar vi delvis gallgången ligering som kirurgiska modell av leverskada och förnyelse i gnagare.
Abstract
Hos gnagare är komplett gallgången ligatur (cBDL) av gallgången en etablerad kirurgisk teknik för att studera obstruktiv kolestas och gallgången spridning. Långsiktiga experiment kan dock leda till ökad sjuklighet och dödlighet. I Välj mus stammar med underliggande leversjukdom, kan meningsfulla jämförelser göras även med ligering av en enstaka LOB i levern, vilket kan minska animaliskt förluster och kostnader. Här beskriver vi delvis gallgången ligatur (pBDL) i musen, där endast den vänstra nedsatt gallgången är sammanskrivna, orsakar biliär obstruktion i den vänstra loben men inte återstående loberna. Med försiktig mikrokirurgisk teknik, kan pBDL experiment vara kostnadseffektiv, eftersom den unligated LOB fungerar som en intern kontroll till att ligated lober, när de utsätts för samma villkor på samma djur. Till skillnad från cBDL är en separat sham manövrerade kontrollgrupp inte nödvändigt. pBDL är mycket användbart att direkt jämföra lokaliserade kontra systemiska effekter av kolestas och andra balanserade galla komponenter. pBDL kan också vara repurposed som en ny metod för att undersöka mekanismer relaterade till mediciner och cellmigration.
Introduction
Kirurgiska modeller för akut leverskada och reparation, såsom partiell hepatectomy eller gallgången ligatur (cBDL), har använts i årtionden i gnagare för att studera lever regenerering och patobiologi1,2. I cBDL, är den gemensamma gallgången (som dränerar alla galla produceras i levern) sammanskrivna, vilket resulterar i obstruktiv kolestas, inflammation och fibros i de första 2-3 veckorna efter operation, med eventuell progression till cirros3. Gallgången spridning, transdifferentiation och induktion av bosatta lever stamceller är också inslag av cBDL4,5. Även om cBDL belyser särskilda mekanismer av obstruktiv cholangiopathy, som är välkarakteriserad med reproducerbara resultat i vildtyp möss och i dessa stammar med normal lever6,7,8, den förfarandet kan vara tekniskt krävande i vissa transgena musmodeller av leversjukdomar, som kräver fler djur än väntat på grund av högre sjuklighet och dödlighet av biliär obstruktion över tid. Denna teknik är också fördelaktigt för att studera transgena möss med underliggande lever sjukdom, som inte kanske annars tål stress av långvarig tid kursen experiment efter cBDL.
pBDL kan ge ett rimligt alternativ för att övervinna några av dessa utmaningar. Inledande pBDL studier i vildtyp möss syftar till att skilja lokalt verkande och systemisk mediatorer av inflammation9. Huvudsakliga biliär sammanflödet av höger och vänster nedsatt gallgångarna ovan gallgången visualiseras noggrant vid hilum i pBDL, och endast den vänstra nedsatt gallgången är sammanskrivna för att generera en lokaliserad obstruktiv kolestas. pBDL erbjuder flera fördelar till cBDL. I pBDL serverar unligated höger lob som identiskt matchade intern kontroll för den ligated vänster LOB, utsätts för samma systemiska effekter, såsom näringsstatus eller cirkulerande faktorer. Systemiska proinflammatoriska mediatorer var närvarande, Osawa et al. observerats mindre fibros och nekros i unligated loberna, men ökade inflammatoriska celler och omvandla tillväxt factor-β uttryck i sammanskrivna LOB9.
Mer nyligen, pBDL har omdefinierats för att studera lever parenkymal effekterna av balanserade galla10. Genom att använda samma djur för intern kontroll (unligated ”bluff”) och experimentella grupper, halverar pBDL effektivt antalet djur behövs per experiment, som i sin tur är mer kostnadseffektivt. Mössen tolerera effekterna av pBDL mycket bättre, så att en idealisk tid kursen experimentera (≥ 2 veckor) kan uppnås i de ligated LOB. Viktigast av allt, pBDL kan skilja direkta intrahepatisk effekterna av obstruktiv kolestas och behållit galla komponenter i den ligated LOB, jämfört med den unligated kontroll loben. Övergripande, pBDL är en attraktiv metod att studera LOB-specifika effekter av lokaliserade kolestas i levern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om cBDL är den vanligaste experimentella tekniken för obstruktiv kolestas, kan den lägga fram flera utmaningar på gnagare. Beroende på antalet postoperativa dagarna krävs för att uppnå en slutpunkt, kan djuren upplever betydande sjuklighet och dödlighet allteftersom tiden går. Graden av vävnadsskada och biliär nekros förvärras ytterligare när du arbetar med vissa transgena musmodeller av leversjukdom, som visar onormala lever parenkymet och funktion vid baslinjen. Jämfört med cBDL, rapporter om pBD…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Khan erkänner bidragsstöd från NIH/NICHD K12HD052892, alfa-1 Stiftelsen, Stiftelsen Hillman och Pittsburgh levern Research Center. Dr. Michalopoulos erkänner bidragsstöd från NIH/NIDDK P01DK096990. Vi uppskattar utmärkt och generösa tekniskt bistånd av Anne Orr. Vi är också tacksamma mot Dr David A. Geller för att ge åtkomst till transplantation/gnagare Microsurgery lab.
Materials
| Microscope-Leica Wild M650, 6–40× magnification | Leica Microsystems | n/a | |
| Tec 3 isoflurane funnel fill vaporizer | General Anesthetic Services | n/a | |
| Stevens Tenotomy Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation | ASSI.9193 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | |
| Mosquito classic delicate hemostatic forceps | Codman | 30-4472 | |
| Micro-retractor | Murdock; Roboz Surgical Instrument | RS-6550 | |
| Nonwoven gauze sponges | Fisherband | 870-PC-DBL | |
| Puritan 6” Small Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company | 868-WCS | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Straight/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-23 | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Angled 45°/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-25 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine science tools | 15000-00 | |
| Microneedle holder | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | |
| Micro AROSuture, sterile 10-0 nylon suture, 70 µm, TAP points | AROSurgical Instruments Corporation | T4A10N07 | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J662H | |
| 5-ml Syringe | BD | 309646 | |
| Falcon tissue culture dish, 60 × 15 mm | Corning | 353002 | |
| Isoflurane, United States Pharmacopeia (USP) liquid for inhalation, 250 ml | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | |
| Buprenex injectable (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496-0757-1 | |
| Cefazolin for injection , USP | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-238-61 | |
| PVP scrub solution (povidone–iodine 7.5%) | Medline | NDC 12496-0757-1 | |
| 70% Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Phosphate Buffered Saline Without Calcium or Magnesium | LONZA | 17-516F | |
| Sirius Red | Sigma | 365548 | |
| Hematolxylin | Fisher (Richard-Allan Scientific) | 22-050-111 (7211) | |
| Eosin | Anatech (Fisher) | 832 (NC9686037) | |
| Formalin | Fisher | SF100-20 |
Referências
- Higgins, G. M., Anderson, R. Experimental pathology of the liver – Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. The Journal of Pathology and Bacteriology. 35 (5), 769-798 (1932).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Michalopoulos, G. K., Barua, L., Bowen, W. C. Transdifferentiation of rat hepatocytes into biliary cells after bile duct ligation and toxic biliary injury. Hepatology. 41 (3), 535-544 (2005).
- Dipaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Guyot, C., Combe, C., Desmouliere, A. The common bile duct ligation in rat: A relevant in vivo model to study the role of mechanical stress on cell and matrix behaviour. Histochem Cell Biol. 126 (4), 517-523 (2006).
- Zhang, Y., et al. Effect of bile duct ligation on bile acid composition in mouse serum and liver. Liver Int. 32 (1), 58-69 (2012).
- Tag, C. G., et al. Bile duct ligation in mice: induction of inflammatory liver injury and fibrosis by obstructive cholestasis. J Vis Exp. (96), e52438 (2015).
- Osawa, Y., et al. Systemic mediators induce fibrogenic effects in normal liver after partial bile duct ligation. Liver Int. 26 (9), 1138-1147 (2006).
- Khan, Z., et al. Bile Duct Ligation Induces ATZ Globule Clearance in a Mouse Model of alpha-1 Antitrypsin Deficiency. Gene Expr. 17 (2), 115-127 (2017).
- Birkhead, H. A., Briggs, G. B., Saunders, L. Z. Toxicology of cefazolin in animals. J Infect Dis. 128, 378 (1973).
- Kunst, M. W., Mattie, H., van Furth, R. Antibacterial efficacy of cefazolin and cephradine in neutropenic mice. Infection. 7 (1), 30-34 (1979).
- Traul, K. A., et al. Safety studies of post-surgical buprenorphine therapy for mice. Lab Anim. 49 (2), 100-110 (2015).
- Carlson, J. A., et al. Accumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest. 83 (4), 1183-1190 (1989).
- Sifers, R. N., Finegold, M. J., Woo, S. L. Alpha-1-antitrypsin deficiency: accumulation or degradation of mutant variants within the hepatic endoplasmic reticulum. Am J Respir Cell Mol Biol. 1 (5), 341-345 (1989).
- Rudnick, D. A., Shikapwashya, O., Blomenkamp, K., Teckman, J. H. Indomethacin increases liver damage in a murine model of liver injury from alpha-1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 44 (4), 976-982 (2006).
- Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
- Glaser, S. S., Alpini, G. Activation of the cholehepatic shunt as a potential therapy for primary sclerosing cholangitis. Hepatology. 49 (6), 1795-1797 (2009).
- Gurpinar, E., et al. A novel sulindac derivative inhibits lung adenocarcinoma cell growth through suppression of Akt/mTOR signaling and induction of autophagy. Mol Cancer Ther. 12 (5), 663-674 (2013).
- Alpini, G. G., Francis, H., Marzioni, M., Venter, J., Phinizy, J., LeSage, G. . Madame Curie Bioscience Database. , (2013).
- Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J Surg Res. 164 (2), 221-227 (2010).
- Delhove, J. M., et al. Longitudinal in vivo bioimaging of hepatocyte transcription factor activity following cholestatic liver injury in mice. Sci Rep. 7, 41874 (2017).
- Li, C., et al. Homing of bone marrow mesenchymal stem cells mediated by sphingosine 1-phosphate contributes to liver fibrosis. J Hepatol. 50 (6), 1174-1183 (2009).
- Xu, J., et al. Factors released from cholestatic rat livers possibly involved in inducing bone marrow hepatic stem cell priming. Stem Cells Dev. 17 (1), 143-155 (2008).
- Sharma, S., et al. Propitious role of bone marrow-derived mononuclear cells in an experimental bile duct ligation model: potential clinical implications in obstructive cholangiopathy. Pediatr Surg Int. 29 (6), 623-632 (2013).
