BLISS, en dobbelt mærkning protokol for at studere lignification dynamics, blev udviklet. Ved hjælp af syntetiske monolignol Klik journalister og en sekventiel kombination af SPAAC og CuAAC bioorthogonal reaktioner, denne metode baner vejen for en dybdegående analyse af de faktorer, der regulerer Biogenese Arabinose i planta.
Lignin er en af de mest udbredte Biopolymerer på planeten og en større komponent af lignocellulose biomasse. Denne phenol polymer spiller en afgørende strukturel og beskyttende rolle i udvikling og liv i højere planter. Selv om de indviklede mekanismer regulere lignification processer i vivo kraftigt påvirker den industrielle revalorisering af mange plante-afledte produkter, har det videnskabelige samfund stadig en lang vej at gå for at dechifrere dem. I en enkel tre-trins arbejdsproces giver dobbelt mærkning protokollen præsenteres heri bioimaging undersøgelser af aktivt lignifying zoner af plantevæv. Det første trin består i den metaboliske indarbejdelse af to uafhængige kemiske reportere, surrogater af de to oprindelige monolignols, der giver anledning til lignin H – og G-enheder. Efter iblandingen i voksende lignin polymerer, er hver reporter derefter specielt mærket med sin egen fluorescerende sonde via en sekventiel kombination af bioorthogonal SPAAC/CuAAC Klik reaktioner. Kombineret med lignin autofluorescence, denne metode fører til, at generation af trefarvet lokalisering kort over lignin inden for plante cellevægge Konfokal Fluorescens mikroskopi og giver præcis geografisk information om tilstedeværelsen eller fraværet af aktive lignification maskiner på omfanget af plantevæv, celler og forskellige cellevæg lag.
I de seneste to årtier fremstod kemiske reporter strategi som en kraftfuld to-trins metode til at undersøge den dynamik og funktioner af ikke-genetisk kodet biomolekyler. 1 , 2 , 3 i denne strategi en syntetisk analog af biomolekyle af interesse med et lille graduering- kemiske reporter – først metaboliseres af den levende organisme, og derefter en kemisk sonde (fx., en fluorophore til fluorescens Konfokal mikroskopi imaging) er kovalent kædet sammen indarbejdet reporter via bioorthogonal Klik kemi. Sonden skal reagere hurtigt og specielt med den indførte kemiske modifikation samtidig være inert til enhver biomolekyler i det levende system. På mange måder overvinder denne metode begrænsningerne af almindelige bioconjugation teknikker ved hjælp af meget specifikke Klik kemi ligations hvilket giver mulighed for at spore metabolitter eller biomacromolecules, der var tidligere utilgængelige i levende systemer4,5,6.
Trods den hurtig voksende popularitet af denne kraftfuld metode i bakteriel og animalske celler er rapporter, der beskrev dets anvendelse i Plantebiologi overraskende få og langt imellem7,8,9,10, 11,12. Vi var især interesseret i at anvende denne strategi i planterne at studere dannelsen af lignin, en af de mest udbredte Biopolymerer på planeten og en større komponent af lignocellulose biomasse. 13 , 14 lignin er et phenolforbindelser polymer, der spiller en afgørende strukturel og beskyttende rolle i udvikling og liv i højere planter.
Det generelt består af tre 4-hydroxyphenylpropanoid fraspaltning: H (p– hydroxyphenyl), G (guaiacyl) og Sørensen (syringyl) enheder henholdsvis stammer fra tre ‘monolignols’ (p– coumaryl, coniferyl og sinapyl alkoholer), der syntetiseres via phenylpropanoid vej i cytoplasma af celle (figur 1). Efter eksporteres til cellens væg, monolignols oxideres til radikaler af peroxidases eller laccases efter som de undergår rent kemisk radikale koblingsreaktioner at polymerisere på lignin polymerer, en proces, der kaldes lignification. 15 , 16 selv om Arabinose kraftigt påvirker den industrielle revalorisering af mange plante-afledte produkter, det videnskabelige samfund har stadig en lang vej at gå for at dechifrere de indviklede mekanismer, der regulerer lignification.
Figur 1: lignification processen på planteceller. Monolignols er biosynthesized fra phenylalanin i cytosol. Efter eksporteres til cellens væg, monolignols oxideres til radikaler af peroxidases eller laccases efter som de undergår rent kemisk radikale koblingsreaktioner at polymerisere på lignin polymerer, en proces, der kaldes lignification. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Selv om rapporterne om brug af bioorthogonal reaktioner glycan analyse er talrige,2,3,17 deres applikationseksempler til andre typer af biomolekyler er færre. Brug af bioorthogonal kemi til lignin bioimaging formål var først for nylig pioneered af Tobimatsu et al. 8 i Arabidopsis thaliana at give oplysninger om integreringen af coniferyl alkohol surrogater i lignin polymer hvor det danner G enheder,8,9 således demonstrere proof of concept, kemiske reporter strategier er relevant i denne sammenhæng. Brugen af CuAAC blev også illustreret ved hjælp af en anden coniferyl alkohol afledede et par måneder senere af Bukowski mfl. 9 men lignin også indeholder H og S enheder og en dybere forståelse af lignification-processen kræver mere viden om, hvordan alle monolignols er indarbejdet i polymeren og hvilke faktorer kan kontrollere dens sammensætning. Nye fremskridt inden for dette felt afhænger i øjeblikket udvikling af effektive metoder til at spore flere kemiske reportere samtidigt i levende systemer. Selvom et par artikler om glycans har lagt grundstenen i de seneste år18,19,20,21,22, dobbelt mærkning tilgange er fortsat en stor udfordring i bioorthogonal kemi. Hvis en reproducerbar mærkning af enkelt klik protokol er svært at udvikle, derefter dobbelt mærkning tilgange, der kræver optimering i tandem af to gensidigt er kompatible bioorthogonal reaktioner på to separate kemiske journalister endnu sværere. De få eksempler, der var pioner for dette aspekt anvendes en kombination af stamme-forfremmet indeholder-alkyn cycloaddition (SPAAC) og Alken-tetrazine inverse elektroniske efterspørgsel Diels-elletræ (DAinv) reaktioner til at studere glycans i animalske celler. Men vi troede, at bioorthogonality af DAinv reaktionen ikke kunne garanteres i dette program på grund af de strukturelle egenskaber af lignin (som består af elektron-rige substituerede cinnamyl-type monomerer, der kan reagere med elektron-fattige Diener såsom tetrazine sonder anvendes i DAinv reaktioner) og at dette kan generere non-specifik mærkning. Desuden DAinv reaktion kræver kemiske håndtag, som er syntetisk vanskelige adgang, samt at være voluminøse og lipofile derved øge muligheden for at satsen for iblanding, transport og/eller lokalisering af kemiske reporter i vivo kan blive påvirket. Da vi mente, at det sidstnævnte aspekt særlig relevant for en klik kemi tilgang til at studere lignification, vi valgte en anden retning og udviklet en Bioorthogonal ligatur Imaging sekventielle strategi (LYKSALIGHED) ved hjælp af en kombination af Strain-Promoted indeholder-alkyn Cycloaddition (SPAAC) og kobber katalyseret indeholder-alkyn Cycloaddition (CuAAC) in vivo. 23
Disse to reaktioner er faktisk de to vigtigste bioorthogonal Klik reaktioner, der har været anvendt til dato, og især i de få eksempler på lignin imaging, blev for nylig offentliggjort. 8 , 9 vores dobbelt mærkning strategi muliggør brug af en indeholder gruppe på én monolignol reporter og en terminal alkyn på den anden side to kemiske håndtag, der er i) ureaktivt mod biologisk relevante strukturer og ii) meget lille i størrelse (figur 2 ). Som følge, virkningen af disse syntetiske ændringer på de fysisk-kemiske egenskaber af biomolekyle under undersøgelse er minimeret dermed reducere eventuelle uoverensstemmelser mellem de unaturlige og naturlige monolignol substrater med hensyn til transport og metabolisme priser under trinnet metaboliske indarbejdelse. Selv om kombinationen af SPAAC og CuAAC synes meget intuitive ved første øjekast, er det til vores viden kun det andet eksempel af dobbelt mærkning ved hjælp af denne strategi og den første ansøgning om strukturer end glycans. 12 , 23
Figur 2: LYKSALIGHED dobbelt mærkning strategi. Kemiske reportere HAZ og GALK er mærket analoger af de indfødte H og G monolignols. De indgår først i de voksende lignin polymerer af cellevægge af eksogen fodring (trin 1). Cyclooctyne – og indeholder-functionalized fluorescerende sonder er derefter sekventielt forbundet til de indbyggede journalister ved bioorthogonal Klik kemi: SPAAC reaktion (trin 2) er meget specifik i HAZ enheder og efterfølges af en CuAAC reaktion ( trin 3) der er specifikke for GALK enheder (trin 3), således at de specifikke lokalisering af begge journalister uafhængigt i samme prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Vi først udviklet og valideret indeholder-markeret monolignol reporter HAZ (surrogat p– coumaryl alkohol) og forløber lignin H enheder og derefter udtænkt den LYKSALIGHED dobbelt mærkning strategi, hvor det bruges sammen med den tidligere rapporteret alkyn-tagged GALK,9 (surrogat coniferyl alkohol) og forløber lignin G enheder. I denne reproducerbare protokol udviklet og testet i hør, er en økonomisk vigtige plantearter, dobbelt metaboliske indarbejdelse af HAZ og GALK i lignin først opnået inden sekventielle SPAAC/CuAAC mærkning. Her, er tagged HAZ enheder først specielt mærket via SPAAC ligatur af en cyclooctyne-functionalized fluorophore, efterfulgt af CuAAC-medieret ligatur af en anden fluorescerende sonden på mærket GALK enheder. Denne metode blev brugt til at undersøge dynamikken i lignification processer inden for plante cellevægge og kan blive anvendt i vivo at dæmme op for tværsnit, bor stængler samt frøplanter af forskellige plantearter.
Som tidligere nævnt er den dobbelte mærkning BLISS protokollen præsenteret i dette papir en af de første eksempler på en SPAAC/CuAAC kombination i vivo12,23. Hvert skridt var grundigt optimeret og valideret, og det er meget vigtigt, at den rækkefølge, hvori de to klik kemi mærkning reaktioner udføres sekventielt overholdes (dvs. SPAAC først, efterfulgt af CuAAC). Alle tværs-kontrol viste, at hver mærkning skridt er specifikke når BLISS-protokollen er anvendt23 : udføre SPAAC trin først fører til meget chemoselective mærkning af HAZ indeholder funktioner af den cyclooctyne-functionalized fluorophore gennem en [3 + 2] cycloaddition reaktion med hurtig kinetik. Når HAZ enheder er markeret, er det CuAAC skridt nødvendiggør kobber (i) katalyseret aktivering af GALK terminal Alkyner at generere triazoler links ved reaktion med indeholder-fluor 545 sonden, kan gennemføres. I kontrast, den omvendte rækkefølge (dvs. CuAAC først, efterfulgt af SPAAC) bør ikke anvendes, da det fører til GALK og HAZ enhed cross-kobling, som konkurrerer med fluorophore ligatur og inducerer en dramatisk tab af signal . Det er også vigtigt at understrege nødvendigheden af de mellemliggende vask skridt til at undgå uspecifik farvning.
Vi har vist, at vores metode kan anvendes på forskellige biologiske eksperiment designs. BLISS mærkning protokol blev første gang anvendt på Frihånd tværsnit af hør stilke (ca. 150-250 µm tykt), der tidligere blev skåret og inkuberes med klik-klar monolignols. Selv om dette design har fordelen at minimere de nødvendige mængder af kemiske reporter (som inkubation diskenheder er reduceret) og at fremme produktionen af statistiske replikater, det er ikke strengt taget en in vivo -system og i nogle tilfælde, kan ikke afspejle alle aspekter af virkelige spatio-temporal lignification dynamics. I en anden eksperimentel design tilpasset vi derfor BLISS protokol til en metode, der tidligere blev brugt til at studere indarbejdelse af radiolabeled monolignols i fyrretræ og gingko27. I denne tilgang, rødder og stængel af planten er fysisk adskilt og bunden af hele stammen er udruget i monolignol-løsningen i hvad kan blive døbt ‘blomstervase’ tilgang. Efter at have forladt stilke den ønskede (inkubationstiden), er tværsnit cut og BLISS protokollen udføres. Dette tillod os at vise (i) at de modificerede monolignols transporteres gennem levende stilken og er indarbejdet i voksende lignin polymerer i cellevægge og (ii) at lokalisering mønster var det væsentlige identisk med tværsnit tilgang. Denne type af eksperiment udmærker sig ved at være udført i en rigtig levende plante / levende celle tilgang tillader længere eksperimenter og mere dybtgående undersøgelser, men kræver større mængder af kemiske reporter. Endelig, BLISS protokollen blev også brugt med hørplanten frøplanter, der repræsenterer en rigtig levende plante model hvor de kemiske journalister skal blive absorberet gennem rødderne inden den transporteres op stilken. Mens denne model har den klare fordel af at være udførte i levende planter, i praksis, det er begrænset til unge frøplanter og er ikke rigtig egnet til at undersøge lignification dynamics i ældre planter af praktiske grunde (lang inkubationstid tid, forhøjet mængden af kemiske journalister). Alligevel, disse tre eksperiment designs er komplementære og alle har deres fordele og ulemper med hensyn til praktiske aspekter og biologiske betydning afhængigt af biologiske spørgsmål skal besvares.
Udviklet for at studere lignification dynamik i hør, vores protokol er yderst fleksibel, ikke kun med hensyn til biologiske eksperimentdesign, men også med hensyn til dets anvendelse til andre plante arter og organer/væv. For eksempel, kan BLISS nemt overføres til Arabidopsis eller Populus slægter, der er mere åbne over for undersøgelser med knock-out eller knock-down mutanter for forskellige gener. I princippet, kan dobbelt mærkning undersøgelser med vores tilgang også udvides til at omfatte andre biomolekyler ved hjælp af to forskellige modificerede prækursorer i plant cell wall polymerer – herunder alle tre vigtigste monolignols eller deres metaboliske prækursorer såvel som forskellige monosaccharider, der udgør matrixen polysaccharid. Siden starten, er bioorthogonal kemi faktisk hovedsagelig udviklet for at undersøge glycans/polysaccharider gennem metaboliske oligosaccharid engineering (MOE)4,5,17,28, men overraskende der har kun været meget få programmer til at plante biologi hidtil7,8,9,10,11,12. Med hensyn til foreneligheden af reaktionerne var undersøgelse af lignin faktisk en kompleks sag til at løse, som begge kemiske journalister er indarbejdet i den samme retikulerede polymer. Muligheden for uden etiket HAZ–GALK cross-link dannelse var det store problem at overvinde på grund af geografisk nærhed af GALK og HAZ enheder i 3D struktur af lignin23, en begrænsning, der ikke kan være til stede hvis de to kemiske reportere ikke er indarbejdet i den samme type for polymer eller i samme geografiske område for enhver given celle.
I et bredere anvendelsesområde kunne BLISS metode hovedsagelig anvendes på enhver tofarvede fluorescens billeddannelse undersøgelse i bakteriel eller animalske modeller ved hjælp af to forskellige kemiske reportere forsynet med en indeholder og terminal alkyn tag, henholdsvis.
The authors have nothing to disclose.
Vi står i gæld til forskning Federation FRABio og TisBio imaging platform (Univ. Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des assemblager Biomoléculaires) for at give den tekniske miljø bidrager til at opnå dette arbejde.
(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
2% sodium hypochlorite | |||
20 cm high glass tube | |||
250 mL Schott glass bottle | |||
48-well Plate | |||
5/6-TAMRA-PEG3-Azide | Jena Bioscience | CLK-AZ109-1 | |
Aluminium foil | |||
Cheese cloth | |||
Compost containing clay | |||
Coniferyl alcohol (G) | Sigma Aldrich | MFCD00002922 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate | |||
DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110 | Jena Bioscience | CLK-A127-1 | |
Milli-Q Ultrapure water | |||
Eppendorf 1,5 mL | |||
EtOH | |||
Flax seeds (L. usitatissimum L.) | |||
Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
Glass coverslip | |||
Glass microscope slide | |||
Growth chamber | CLF-Plant Climatics | For 2-week-old plants culture | |
Growth chamber | Angelantoni Life Sciences | For 2-month-old plants culture | |
Magenta plant culture box | For 2-week-old seedling culture | ||
Methanol | Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood | ||
Micropipette | |||
Nail polish | |||
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | ||
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
p-Coumaryl alcohol (H) | Carbosynth | FC145653 | |
Plastic cap | |||
Plastic pipette | |||
Plastic pot | For 2-month-old plants culture | ||
Razor blade | |||
Rubber band | |||
Sodium Ascorbate | |||
Sterile clamp | |||
Vertical support | |||
Vortex | |||
Reagents for liquid and solid ½ MS medium | |||
KH2PO4 | |||
KNO3 | |||
NH4NO3 | |||
MgSO4.7H2O | |||
CaCl2.2H2O | |||
MnSO4.H2O | |||
ZnSO4.7H2O | |||
H3BO3 | |||
KI | |||
Na2MoO4.2H2O | |||
CuSO4.5H2O | |||
CoCl2.6H2O | |||
Na2EDTA.2H2O | |||
FeSO4.7H2O | |||
Thiamine.HCl | |||
Pyridoxine.HCl | |||
Glycine | |||
Nicotinic acid | |||
Myo-inositol | |||
Saccharose | |||
MES hydrate | |||
Agar |