BLISS, un etiquetado de dos protocolos para estudiar la dinámica de la lignificación, fue desarrollado. Con sintética monolignol reporteros y una combinación secuencial de bioorthogonal SPAAC y CuAAC haga clic en reacciones, esta pavimenta la manera a un análisis profundo de los factores que regulan la biogénesis de lignina en la plantade la metodología.
La lignina es uno de los biopolímeros más prevalentes en el planeta y un componente importante de la biomasa lignocelulósica. Este polímero fenólico desempeña un papel estructural y protección vital en el desarrollo y vida de las plantas superiores. Aunque los intrincados mecanismos de regulación procesos de lignificación en vivo fuertemente impactan la valorización industrial de muchos productos de origen vegetal, la comunidad científica todavía tiene un largo camino por recorrer para descifrarlos. En un flujo de trabajo de tres pasos simple, el protocolo de etiquetado doble aquí presentado permite estudios de Bioimagen de activamente lignifying zonas de tejidos de la planta. El primer paso consiste en la incorporación metabólica de dos reporteros químicas independientes, sustitutos de los dos monolignols nativas que dan lugar a lignina unidades H y G. Después de la incorporación al cultivo de polímeros de lignina, cada reportero entonces se etiqueta específicamente con su propia sonda fluorescente mediante una combinación secuencial de bioorthogonal SPAAC/CuAAC clic reacciones. Combinado con autofluorescencia de lignina, este enfoque conduce a la generación de mapas de localización tricolor de lignina en las paredes celulares por microscopía de fluorescencia confocal y proporciona información espacial precisa de la presencia o ausencia de activo maquinaria de lignificación en la escala de los tejidos vegetales, células y capas de la pared celular diferente.
En las últimas dos décadas, la estrategia de reportero químico ha emergido como una metodología de dos etapas de gran alcance para investigar la dinámica y funciones de biomoléculas no genéticamente codificados. 1 , 2 , 3 en esta estrategia un análogo sintético de la biomoléculas de interés con una modulación pequeña – el reportero químico – es primero metabolizado por el organismo vivo y luego una sonda química (por ej., un fluoróforo para fluorescencia proyección de imagen de la microscopia confocal) es covalente a la reportera incorporada vía química del tecleo de bioorthogonal. La sonda debe reaccionar rápidamente y específicamente con la modificación introducida química siendo inerte a cualquier biomoléculas presentes en el sistema de vida. En muchos sentidos, este método supera las limitaciones de técnicas bioconjugation comunes a través del uso altamente específico haga clic en trompas de química proporcionando así la oportunidad de rastrear metabolitos o biomacromoléculas que eran previamente inaccesibles en la vida de los sistemas4,5,6.
A pesar de la creciente popularidad de este poderoso método en células bacterianas y animales, informes que describen su uso en Biología Vegetal son sorprendentemente pocos y lejos entre7,8,9,10, 11,12. Estábamos particularmente interesados en la aplicación de esta estrategia en las plantas para el estudio de la formación de la lignina, uno de los biopolímeros más prevalentes en el planeta y un componente importante de la biomasa lignocelulósica. 13 , 14 la lignina es un polímero fenólico que desempeña una función estructural y protectora vital en el desarrollo y vida de las plantas superiores.
Generalmente se compone de tres partes de 4-hydroxyphenylpropanoid: H (p– hidroxifenil), G (guaiacyl) y S (syringyl) unidades derivan respectivamente de tres ‘monolignols’ (p– coumaryl, coniférico sinapyl alcoholes y) que son sintetiza a través de la vía fenilpropanoide en el citoplasma de la célula (figura 1). Después de ser exportado a la pared celular, se oxidan monolignols a los radicales por peroxidasas o lacasas que sufren reacciones puramente químicas acoplamiento radical para polimerizar a los polímeros de lignina, un proceso llamado lignificación. 15 , 16 aunque lignins impactan fuertemente la valorización industrial de muchos derivados de plantas productos, la comunidad científica todavía tiene un largo camino por recorrer para descifrar los intrincados mecanismos de regulación lignificación.
Figura 1: el proceso de lignificación en células de la planta. Monolignols es biosintetizada a partir de fenilalanina en el citosol. Después de ser exportado a la pared celular, se oxidan monolignols a los radicales por peroxidasas o lacasas que sufren reacciones puramente químicas acoplamiento radical para polimerizar a los polímeros de lignina, un proceso llamado lignificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Aunque los informes sobre el uso de reacciones bioorthogonal para el análisis de glicanos son numerosos,2,3,,17 sus ejemplos de aplicación a otros tipos de biomoléculas son menos. El uso de la química bioorthogonal lignina Bioimagen fines fue promovido recientemente por Tobimatsu et al. 8 pt Arabidopsis thaliana para proporcionar información sobre la incorporación de coniférico sustitutos de alcohol en el polímero lignina donde forma las unidades de G,8,9 demostrando así la prueba de concepto que estrategias de reportero químico son aplicables en este contexto. El uso de CuAAC fue también ilustra usando un derivado de alcohol coniférico diferentes unos meses más tarde por Bukowski et al. 9 sin embargo, lignina también contiene unidades H y S y una comprensión más profunda del proceso de lignificación requiere más conocimientos sobre cómo de la monolignols son incorporados en el polímero y qué factores pueden controlar su composición. Nuevos avances en este campo actualmente dependen del desarrollo de metodologías eficientes para seguir simultáneamente varios reporteros químicos en sistemas vivos. A pesar de que algunos artículos sobre glicanos sentaron las bases en los últimos años18,19,20,21,22, doble etiquetado enfoques siguen siendo un reto importante en bioorthogonal química. Si un reproducible etiquetado solo haga clic en protocolo es difícil de desarrollar, entonces doble etiquetado enfoques que requieren la optimización en tándem de dos mutuamente compatible bioorthogonal reacciones en dos reporteros químicos separados están aún más difíciles. Los pocos ejemplos que fue pionera en este aspecto utilizan una combinación de tensión promovido azida-alquino cicloadición (SPAAC) y las reacciones de Diels-Alder (DAinv) de demanda electrónica inversa alkene tetrazina para estudiar glycans en las células animales. Sin embargo, pensamos que la bioorthogonality de la reacción de DAinv no puede ser garantizado en esta aplicación debido a las características estructurales de la lignina (que consiste en monómeros ricos en electrones substituido cinamil-tipo que pueden reaccionar con los pobres en electrones Dienes como las sondas de tetrazina utilizadas en reacciones de DAinv) y que esto puede generar no específicos de etiquetado. Además, la reacción deinv DA requiere manijas químicos sintético difícil acceso, como abultado y lipofílico aumentando la posibilidad de que la tasa de incorporación, transporte o localización de la sustancia reportero en vivo puede verse afectada. Como considera que este último aspecto es particularmente relevante en el caso de un enfoque de química haga clic en para el estudio de lignificación, elegimos una dirección diferente y desarrollado una ligadura del Bioorthogonal imagen secuencial estrategia (BLISS) utilizando un combinación de cicloadición de azidas alquino Strain-Promoted (SPAAC) y cicloadición azida-alquino catalizada por el cobre (CuAAC) en vivo. 23
Estas dos reacciones son los dos bioorthogonal principales, haga clic en reacciones que se han utilizado hasta la fecha, y más particularmente en los pocos ejemplos de la lignina de imágenes han sido publicados recientemente. 8 , 9 nuestra estrategia etiquetado dual permite el uso de una molécula de azida en un monolignol reportero y un alquino terminal por el otro, dos manijas química i) unreactive hacia estructuras biológicamente relevantes y ii) muy pequeño de tamaño (figura 2 ). Como resultado, el impacto de estas modificaciones sintéticas sobre las propiedades fisicoquímicas de las biomoléculas en estudio se reduce al mínimo reduciendo así posibles discrepancias entre los sustratos de monolignol natural y antinatural en términos de transporte y tasas de metabolización durante la etapa de incorporación metabólica. Aunque la combinación de SPAAC y CuAAC parece muy intuitiva a primera vista, es a nuestro conocimiento sólo en el segundo ejemplo de marca dual con esta estrategia y la primera aplicación en estructuras que no sean de glicanos. 12 , 23
Figura 2: BLISS doble etiquetado estrategia. Química reporteros HAZ y GALK son análogos de etiquetado de la nativa monolignols H y G. En primer lugar se incorporan en los polímeros de lignina creciente de las paredes celulares por la alimentación exógena (paso 1). Cyclooctyne – y azida-functionalized sondas fluorescentes entonces se unen secuencialmente a los reporteros incorporados por bioorthogonal química click: la reacción de SPAAC (paso 2) es altamente específica del HAZ unidades y es seguida por un CuAAC reacción ( Paso 3) que es específico de GALK unidades (paso 3), lo que permite la localización específica de ambos reporteros independientemente en la misma muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Diseñado en primer lugar y validado la azida-tagged monolignol reportero HAZ (sustituto de p– coumaryl alcohol) y precursor de las unidades de lignina H y entonces ideó dicha doble estrategia de etiquetado en el que se utiliza en conjunto con la había divulgado previamente etiquetado alquino GALK,9 (sustituto de alcohol coniférico) y precursor de las unidades de G de lignina. En el presente Protocolo reproducible desarrollada y probada en lino, una especie de planta económicamente importante, la doble incorporación metabólica de HAZ y GALK en lignina se logra primero antes de SPAAC/CuAAC secuencial etiquetado. Aquí, etiquetado HAZ unidades primero están marcadas específicamente por medio de la ligadura de la SPAAC de un fluoróforo cyclooctyne funcionalizados, seguida de ligadura CuAAC-mediada de una segunda sonda fluorescente etiquetado GALK unidades. Este método fue utilizado para investigar la dinámica de los procesos de lignificación de las paredes celulares y puede ser aplicada en vivo para cortes transversales, viven tallos y plántulas de diferentes especies de plantas.
Como se mencionó anteriormente, el protocolo de dicha etiquetado doble presentado en este documento es uno de los primeros ejemplos de una combinación SPAAC/CuAAC en vivo12,23. Cada paso fue completamente optimizado y validado, y es muy importante que se respete el orden en que los dos haga clic en química reacciones Etiquetadoras se realizan secuencialmente (es decir, SPAAC primero, seguido por CuAAC). Todos los controles de Cruz-demostraron que cada paso etiquetado específico cuando el protocolo BLISS es aplicada23 : primero llevar a cabo el paso SPAAC conduce a la altamente estereoselectiva de HAZ azida funciones el fluoróforo cyclooctyne funcionalizados mediante una reacción de cicloadición [3 + 2] con cinética rápida. Una vez que se han etiquetado HAZ unidades, puede realizar el paso CuAAC requiere activación de cobre (i) catalizada de GALK alquinos terminales para generar enlaces de triazol por reacción con la sonda 545 azida-fluor. En contraste, el orden inverso (es decir, CuAAC en primer lugar, seguido de SPAAC) no debe utilizarse ya que conduce a la unidad GALK y HAZ Cruz-acoplamiento, que compite con el fluoróforo ligadura e induce una pérdida dramática de la señal . También es importante hacer hincapié en la necesidad de los pasos de lavado intermedio para evitar la tinción inespecífica.
Hemos demostrado que nuestro método puede aplicarse a varios diseños de experimento biológico. La dicha etiqueta protocolo primero fue aplicada a cortes transversales a mano alzada de tallos de lino (aproximadamente 150-250 μm de espesor) que previamente se corte y se incubaron con el monolignols haga clic en listo. Aunque este diseño tiene la ventaja de minimizar las cantidades necesarias de reportero químico (como se reducen los volúmenes de incubación) y de facilitar la producción de estadística se replica, no es, estrictamente hablando, un sistema en vivo y en algunos casos, puede no reflejar todos los aspectos de la dinámica espacio-temporal real lignificación. En un segundo diseño experimental, por lo tanto adaptamos el protocolo de felicidad a un método que fue utilizado previamente para estudiar la incorporación de monolignols radiomarcado en pino y gingko27. En este enfoque, las raíces y el tallo de la planta están físicamente separados y la base del tallo entero se incuba en la solución de monolignol en lo que puede ser llamado el enfoque ‘florero’. Después de dejar los tallos el tiempo deseado (incubación), secciones transversales son corte y el protocolo de BLISS realizada. Esto nos permitió mostrar (i) que el monolignols modificados son transportados a través de la espiga de la vida y se incorporan en el crecimiento de polímeros de lignina en las paredes celulares y (ii) que el patrón de localización era esencialmente idéntico a la de la sección transversal enfoque. Este tipo de experimento tiene el mérito de ser realizada en una planta de la vida real / células vivas acercamiento permitiendo más experimentos y estudios más exhaustivos, pero requiere mayores cantidades de reportero químico. Finalmente, el protocolo de felicidad también se usó con plántulas de la planta del lino, que representan un verdadero modelo de planta en la que los reporteros química deben ser absorbidos por las raíces antes de ser transportados hasta la madre de vivir. Mientras que este modelo tiene la clara ventaja de ser realizada en plantas vivas, en la práctica, se limita a las plántulas jóvenes y no es realmente adecuado para investigar la dinámica de la lignificación en plantas más viejas por razones prácticas (tiempo de incubación largo, elevado cantidad de reporteros química). Sin embargo, estos diseños de tres experimento son complementarios y todos tienen sus pros y contras con respecto a los aspectos prácticos y significación biológica dependiendo del tipo de cuestión biológica a ser contestadas.
Desarrollado para estudiar la dinámica de la lignificación en lino, nuestro protocolo es altamente adaptable, no sólo en términos de diseño de experimento biológico, sino también en cuanto a su aplicación a otras plantas de especies y órganos/tejidos. Por ejemplo, felicidad puede ser fácilmente transferida a la Arabidopsis o los géneros Populus que son más susceptibles a los estudios con mutantes knock-out o knock-down para varios genes. En principio, estudios de etiquetado doble con nuestro enfoque pueden extenderse también a otras biomoléculas mediante el uso de dos distintos precursores modificadas de polímeros de pared celular de plantas – incluyendo todos tres monolignols principal o sus precursores metabólicos así como varios monosacáridos que constituyen la matriz de polisacárido. Desde sus inicios, bioorthogonal química de hecho fue principalmente desarrollado para investigar glycans/polisacáridos a oligosacáridos metabólica Ingeniería (MOE)4,5,17,28, Pero sorprendentemente ha habido solamente muy pocas aplicaciones a biología de la planta hasta7,8,9,10,11,12. En cuanto a la compatibilidad de las reacciones, el estudio de la lignina fue de hecho un caso complejo para resolver como dos reporteros químicos se incorporan en el mismo polímero reticulado. La posibilidad de HAZ–GALK reticulación formación era el principal problema a superar debido a la proximidad espacial de GALK y HAZ unidades dentro de la 3D estructura de lignina23, una limitación que no puede estar presente si no se incorporan los dos reporteros de químicos en el mismo tipo de biopolímero o en la misma región espacial de cualquier célula dada.
En un ámbito más amplio la dicha metodología esencialmente podría aplicarse a cualquier estudio de imágenes de fluorescencia de dos colores en modelos animales o bacterianos utilizando dos reporteros química distintos teniendo una azida y etiqueta del alquino terminal, respectivamente.
The authors have nothing to disclose.
Estamos agradecidos a la investigación Federación FRABio y la plataforma de proyección de imagen de TisBio (Univ. de Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Biomoléculaires funcional des conjuntos) para proporcionar el entorno técnico conducente a la consecución de este trabajo.
(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
2% sodium hypochlorite | |||
20 cm high glass tube | |||
250 mL Schott glass bottle | |||
48-well Plate | |||
5/6-TAMRA-PEG3-Azide | Jena Bioscience | CLK-AZ109-1 | |
Aluminium foil | |||
Cheese cloth | |||
Compost containing clay | |||
Coniferyl alcohol (G) | Sigma Aldrich | MFCD00002922 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate | |||
DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110 | Jena Bioscience | CLK-A127-1 | |
Milli-Q Ultrapure water | |||
Eppendorf 1,5 mL | |||
EtOH | |||
Flax seeds (L. usitatissimum L.) | |||
Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
Glass coverslip | |||
Glass microscope slide | |||
Growth chamber | CLF-Plant Climatics | For 2-week-old plants culture | |
Growth chamber | Angelantoni Life Sciences | For 2-month-old plants culture | |
Magenta plant culture box | For 2-week-old seedling culture | ||
Methanol | Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood | ||
Micropipette | |||
Nail polish | |||
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | ||
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
p-Coumaryl alcohol (H) | Carbosynth | FC145653 | |
Plastic cap | |||
Plastic pipette | |||
Plastic pot | For 2-month-old plants culture | ||
Razor blade | |||
Rubber band | |||
Sodium Ascorbate | |||
Sterile clamp | |||
Vertical support | |||
Vortex | |||
Reagents for liquid and solid ½ MS medium | |||
KH2PO4 | |||
KNO3 | |||
NH4NO3 | |||
MgSO4.7H2O | |||
CaCl2.2H2O | |||
MnSO4.H2O | |||
ZnSO4.7H2O | |||
H3BO3 | |||
KI | |||
Na2MoO4.2H2O | |||
CuSO4.5H2O | |||
CoCl2.6H2O | |||
Na2EDTA.2H2O | |||
FeSO4.7H2O | |||
Thiamine.HCl | |||
Pyridoxine.HCl | |||
Glycine | |||
Nicotinic acid | |||
Myo-inositol | |||
Saccharose | |||
MES hydrate | |||
Agar |