BLISS, en dubbel märkning protokoll för att studera lignification dynamik, utvecklades. Reportrar och en sekventiell kombination av SPAAC och CuAAC bioorthogonal klicka med syntetiska monolignol reaktioner, denna metod banar vägen till djupgående analys av de faktorer som reglerar biogenes av lignins i planta.
Lignin är en av de vanligaste biopolymerer på planeten och en viktig del av lignocellulosa biomassa. Denna fenoliska polymer spelar en viktig strukturell och skyddande roll i utvecklingen och livet av högre växter. Även om de intrikata mekanismer som reglerar lignification processer i vivo starkt påverkar de industriella valorizationen av många vegetabiliska produkter, har det vetenskapliga samfundet fortfarande en lång väg att gå för att dechiffrera dem. I ett enkelt arbetsflöde i tre steg gör dubbel märkning protokollet presenteras häri bioimaging studier av aktivt lignifying zoner av växt vävnader. Det första steget består i metabola införlivandet av två oberoende kemiska reportrar, ersättningar för de två inhemska monolignoler som ger upphov till lignin H – och G-enheter. Efter inblandning i växande lignin polymerer, är varje reporter sedan specifikt märkt med egen fluorescerande sond via en sekventiell kombination av bioorthogonal SPAAC/CuAAC Klicka reaktioner. Kombinerat med lignin autofluorescens, detta synsätt leder till generation av tre färger lokalisering kartor av lignin i växternas cellväggar av confocal fluorescensmikroskopi och ger exakt rumslig information på närvaro eller frånvaro av aktiva lignification maskiner på omfattningen av växt vävnader, celler och olika cellväggen lager.
Under de senaste två decennierna, kemiska reporter strategin har vuxit fram som en kraftfull två-stegs metod för att undersöka de dynamics och funktioner för icke-genetiskt kodade biomolekyler. 1 , 2 , 3 i denna strategi en syntetisk analog av biomolecule intresse med en liten modulering – kemiska reporter – först metaboliseras av den levande organismen, och sedan en kemisk sond (t.ex., en fluorophore för fluorescens konfokalmikroskopi imaging) är kovalent kopplad till bolagiserade reporter via bioorthogonal Klicka på kemi. Sonden måste reagera snabbt och specifikt med den introducerade kemisk modifieringen samtidigt vara inert till någon biomolekyler som är närvarande i levande system. På många sätt övervinner denna metod begränsningarna av vanliga bioconjugation tekniker med hjälp av mycket specifika Klicka kemi nering vilket ger möjlighet att spåra metaboliter eller biomakromolekyler som tidigare otillgängliga i levande system4,5,6.
Trots den snabb växande populariteten för denna kraftfulla metod i bakteriell och djurs celler är rapporter som beskriver dess användning i växtbiologi förvånansvärt få och långt mellan7,8,9,10, 11,12. Vi var särskilt intresserade av att tillämpa denna strategi i växter att studera bildandet av lignin, en av de vanligaste biopolymerer på planeten och en viktig del av lignocellulosa biomassa. 13 , 14 lignin är en fenol polymer som spelar en viktig strukturell och skyddande roll i utvecklingen och livet av högre växter.
Den allmänt består av tre 4-hydroxyphenylpropanoid beståndsdelarna: H (p– hydroxifenyl), G (guaiacyl) och S (syringyl) enheter respektive härrör från tre ‘monolignoler’ (p– coumaryl, coniferyl och sinapyl alkoholer) som är syntetiseras via den phenylpropanoid vägen i cytoplasman i cellen (figur 1). Efter att ha förts till cellväggen, monolignoler oxideras med radikaler av peroxidaser eller laccases varefter de genomgår renodlat kemiskt radikala koppling reaktioner att polymerisera till lignin polymerer, en process som kallas lignification. 15 , 16 även om lignins starkt påverkar de industriella valorizationen av många vegetabiliska produkter, det vetenskapliga samfundet ännu en lång väg att gå för att dechiffrera de intrikata mekanismer som reglerar lignification.
Figur 1: lignification processen i växtceller. Monolignoler är biosyntetiseras från fenylalanin i cytosolen. Efter att ha förts till cellväggen, monolignoler oxideras med radikaler av peroxidaser eller laccases varefter de genomgår renodlat kemiskt radikala koppling reaktioner att polymerisera till lignin polymerer, en process som kallas lignification. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Även rapporter om användningen av bioorthogonal reaktioner för glykananalys är talrika,2,3,17 deras applikationsexempel till andra typer av biomolekyler är färre. Användning av bioorthogonal kemi för lignin bioimaging var bara nyligen uppfunnen av Tobimatsu et al. 8 i Arabidopsis thaliana att tillhandahålla information om införlivandet av coniferyl alkohol surrogat till lignin polymeren där den bildar G andelar,8,9 vilket visar bevis på koncept som kemiska reporter strategier är tillämpliga i detta sammanhang. Användning av CuAAC också illustrerades med ett derivat med olika coniferyl i alkohol ett par månader senare av Bukowski et al. 9 dock lignin innehåller också H och S enheter och en djupare förståelse för den lignification processen kräver mer kunskap om hur alla monolignoler inlemmas i polymeren och vilka faktorer kan styra dess sammansättning. Nya framsteg inom detta område är för närvarande beroende av utvecklingen av effektiva metoder för att spåra flera kemiska reportrar samtidigt i levande system. Även om några artiklar om glycans har grunden i senaste åren18,19,fortfarande20,21,22, dubbel märkning metoder en stor utmaning i bioorthogonal kemi. Om en reproducerbar singel-märkning Klicka protokollet är svårt att utveckla, sedan dubbla märkning metoder som kräver optimering parallellt två ömsesidigt är kompatibla bioorthogonal reaktioner på två separata kemiska reportrar ännu svårare. Några exempel som banade väg för denna aspekt används en kombination av stam-främjade natriumazid-alkynen cykloadditionen (SPAAC) och alkene-tetrazine omvänd elektroniska efterfrågan Diels-Alder (DAinv) reaktioner för att studera glycans i djurceller. Men, vi trodde att bioorthogonality DAinv reaktionen inte kan garanteras i denna ansökan på grund av de strukturella funktionerna av lignin (som består av elektron-rika substituerade cinnamyl-typ monomerer som kan reagera med elektron-fattiga Diener såsom de tetrazine sonder används i DAinv reaktioner) och att detta kan generera icke-specifik märkning. Dessutom DAinv reaktionen kräver kemiska handtag som är syntetiskt svåra att tillgång, som är skrymmande och lipofila därmed höja möjligheten som graden av införlivandet, transporter eller lokalisering av kemikalien reporter i vivo kan påverkas. Eftersom vi ansåg att den sistnämnda aspekten var särskilt relevant när det gäller en klick kemi strategi för att studera lignification, vi valde en annan riktning och utvecklat ett Bioorthogonal ligatur Imaging sekventiella strategi (BLISS) använder en kombination av Strain-Promoted natriumazid-alkynen cykloadditionen (SPAAC) och koppar katalyseras natriumazid-alkynen cykloadditionen (CuAAC) invivo. 23
Dessa två reaktioner är verkligen de två huvudsakliga bioorthogonal Klicka på reaktioner som har använts hittills, och närmare bestämt i de få exemplen på lignin imaging som nyligen publicerades. 8 , 9 vår dubbel märkning strategi möjliggör användning av en natriumazid biexponentiellt på en monolignol reporter och en terminal alkynen å andra sidan, två kemiska handtag som är i) föga reaktivt mot biologiskt relevanta strukturer och ii) mycket liten i storlek (figur 2 ). Som ett resultat, effekterna av dessa syntetiska modifieringar på fysikalisk-kemiska egenskaperna hos biomolecule under studie minimeras vilket minskar eventuella skillnader mellan de onaturliga och naturliga monolignol substratesna när det gäller transport och metabolisering priser under metabola införlivande steg. Även om kombinationen av SPAAC och CuAAC verkar mycket intuitiv vid första anblicken, är det att vår kunskap bara det andra exemplet av dubbla märkningen med denna strategi och den första ansökningen på strukturer än glycans. 12 , 23
Figur 2: BLISS dubbel märkning strategi. Kemiska reportrar HAZ och GALK är märkta analoger av den infödda H och G monolignoler. De först införlivas i de växande lignin polymererna av cellväggar av exogena utfodring (steg 1). Cyclooctyne – och natriumazid-functionalized fluorescerande sonder är sedan sekventiellt sammanskrivna att bolagiserade reportrar av bioorthogonal Klicka på kemi: SPAAC reaktionen (steg 2) är mycket specifika HAZ enheter och följs av en CuAAC reaktion ( steg 3) som är specifikt GALK enheter (steg 3), vilket möjliggör specifika localizationen av båda reportrar självständigt i samma prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vi först konstruerade och validerade natriumazid-taggade monolignol reporter HAZ (surrogat p– coumaryl alkohol) och föregångare av lignin H enheter och sedan utarbetat den BLISS dubbel märkning strategi där det används parallellt med den tidigare rapporterade alkynen-märkta GALK,9 (surrogat coniferyl alkohol) och föregångare av lignin G-enheter. I detta reproducerbara protokoll utvecklas och testas i lin, uppnås en ekonomiskt viktig växtarter, dubbla metabola införlivande av HAZ och GALK lignin först före sekventiell SPAAC/CuAAC märkning. Här, märkta märkta HAZ enheter först särskilt via den SPAAC ligation av en cyclooctyne-functionalized fluorophore, följt av CuAAC-medierad ligering av en andra fluorescerande sond på märkta GALK enheter. Denna metod användes för att undersöka dynamiken av lignification processer i växternas cellväggar och kan vara tillämpad i vivo att hejda tvärsnitt, living stjälkar samt plantor av olika växtarter.
Som tidigare nämnts är dubbel märkning BLISS protokollet presenteras i denna uppsats en av de första exemplen på en SPAAC/CuAAC kombination i vivo12,23. Varje steg var noggrant optimerad och valideras, och det är mycket viktigt att den ordning i vilken de två klicka kemi märkning reaktioner sker sekventiellt respekteras (dvs. SPAAC först, följt av CuAAC). Alla cross-kontroller visade att varje märkning steg är specifik när protokollet BLISS är tillämpad23 : utför det SPAAC steget först leder till den mycket chemoselective märkning av HAZ natriumazid funktioner genom den cyclooctyne-functionalized fluorophore genom en [3 + 2] cykloadditionen reaktion med snabb kinetik. När HAZ enheter är märkta, kan det CuAAC steget nödvändiggör copper(I) katalyseras aktivering av GALK terminal alkyner att generera triazol länkar genom reaktion med natriumazid-fluor 545 sond utföras. I kontrast, omvänd ordning (dvs. CuAAC först, följt av SPAAC) bör inte användas eftersom det leder till enhet GALK och HAZ cross-koppling, som konkurrerar med fluorophore ligering och inducerar en dramatisk förlust av signal . Det är också viktigt att betona behovet av de mellanliggande tvätt steg för att undvika icke-specifik färgning.
Vi har visat att vår metod kan tillämpas på olika biologiska experiment mönster. BLISS märkning protokoll tillämpades först till freehand tvärsnitt av lin stjälkar (ca 150-250 µm tjocka) som tidigare skär och inkuberas med de klick-klar monolignoler. Även denna konstruktion har fördelen att minimera de nödvändiga mängder kemiska reporter (som inkubation Rökgasvolymerna minskas) och underlätta produktionen av statistiska replikat, är det inte, strängt taget, ett in vivo -system och i vissa fall kanske inte återspeglar alla aspekter av verkliga plats-temporal lignification dynamics. I en andra försöksplanering anpassade vi därför BLISS protokollet till en metod som tidigare användes för att studera införlivandet av radiomärkt monolignoler i furu och gingko27. I denna strategi, rötterna och stammen av anläggningen är fysiskt åtskilda och basen av hela stammen inkuberas i monolignol lösningen i vad kan dubbas metoden ‘blomvas’. Efter att ha lämnat stjälkarna i önskad (inkubationstid), är tvärsnitt cut och BLISS protokollet utförs. Detta tillät oss att visa att de modifierade monolignoler transporteras genom levande stammen och införlivas i växande lignin polymerer inom cellväggarna och (ii) att lokalisering mönstret var i huvudsak identisk med tvärsnitt tillvägagångssätt. Denna typ av experiment har fördelen som utförs i en riktig levande växt / levande cell närma möjliggör längre experiment och mer ingående studier, men kräver större mängder kemiska reporter. Slutligen användes också protokollet BLISS med lin växt plantor, som representerar en riktig levande växt modell där kemiska reportrar måste tas upp genom rötterna innan den transporteras upp stammen. Medan denna modell har den klara fördelen utförs i levande växter, i praktiken, det är begränsat till unga plantor och lämpar sig inte riktigt för att utreda lignification dynamik i äldre anläggningar av praktiska skäl (lång inkubationstid, förhöjda (mängd kemiska reportrar). Ändå, dessa tre experiment mönster är kompletterande och alla har sina för- och nackdelar när det gäller praktiska aspekter och biologiska betydelse beroende på vilken typ av biologiska frågan besvaras.
Utvecklats för att studera lignification dynamiken i lin, våra protokoll är mycket anpassningsbar, inte bara när det gäller biologiska experiment design, men också när det gäller dess tillämpning på andra växtarter och organ/vävnader. Exempelvis kan BLISS enkelt överföras till Arabidopsis eller släktena Populus som är mer mottagliga för studier med knock-out eller knock-down mutanter för olika gener. I princip kan dubbla märkning studier med vår metod också utökas till andra biomolekyler med två distinkta modifierade prekursorer av växten cellväggen polymerer – inklusive alla tre huvudsakliga monolignoler eller deras metaboliska prekursorer samt av olika monosackarider som utgör matrisen polysackarid. Sedan starten har har bioorthogonal kemi faktiskt främst utvecklats för att utreda glycans/polysackarider genom metaboliska oligosackarid engineering (MOE)4,5,17,28, men förvånansvärt har förekommit endast mycket få program att plantera biologi hittills7,8,9,10,11,12. När det gäller kompatibilitet av reaktioner var studiet av lignin verkligen ett komplicerat fall att lösa som båda kemiska reportrar införlivas i samma nätstruktur polymeren. Möjligheten att omärkt HAZ–GALK korslänk bildandet var den stora frågan att övervinna på grund av den rumsliga närheten av GALK och HAZ enheter inom 3D struktur av lignin23, en begränsning som inte kan finnas om de två kemiska reportrarna inte införlivas i samma typ av biopolymer eller i samma geografiska region av någon viss cell.
I större omfattning kan BLISS metodiken i huvudsak tillämpas på alla två-färg fluorescens bildtagningsstudie i bakterie- eller animaliska modeller med två distinkta kemiska reportrar uthärda en natriumazid och terminal alkynen tag, respektive.
The authors have nothing to disclose.
Vi står i skuld till den forskning Federation FRABio och TisBio imaging plattform (Univ. Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des assemblage Biomoléculaires) för att tillhandahålla den tekniska miljön bidrar till att uppnå detta arbete.
(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
2% sodium hypochlorite | |||
20 cm high glass tube | |||
250 mL Schott glass bottle | |||
48-well Plate | |||
5/6-TAMRA-PEG3-Azide | Jena Bioscience | CLK-AZ109-1 | |
Aluminium foil | |||
Cheese cloth | |||
Compost containing clay | |||
Coniferyl alcohol (G) | Sigma Aldrich | MFCD00002922 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate | |||
DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110 | Jena Bioscience | CLK-A127-1 | |
Milli-Q Ultrapure water | |||
Eppendorf 1,5 mL | |||
EtOH | |||
Flax seeds (L. usitatissimum L.) | |||
Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
Glass coverslip | |||
Glass microscope slide | |||
Growth chamber | CLF-Plant Climatics | For 2-week-old plants culture | |
Growth chamber | Angelantoni Life Sciences | For 2-month-old plants culture | |
Magenta plant culture box | For 2-week-old seedling culture | ||
Methanol | Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood | ||
Micropipette | |||
Nail polish | |||
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | ||
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
p-Coumaryl alcohol (H) | Carbosynth | FC145653 | |
Plastic cap | |||
Plastic pipette | |||
Plastic pot | For 2-month-old plants culture | ||
Razor blade | |||
Rubber band | |||
Sodium Ascorbate | |||
Sterile clamp | |||
Vertical support | |||
Vortex | |||
Reagents for liquid and solid ½ MS medium | |||
KH2PO4 | |||
KNO3 | |||
NH4NO3 | |||
MgSO4.7H2O | |||
CaCl2.2H2O | |||
MnSO4.H2O | |||
ZnSO4.7H2O | |||
H3BO3 | |||
KI | |||
Na2MoO4.2H2O | |||
CuSO4.5H2O | |||
CoCl2.6H2O | |||
Na2EDTA.2H2O | |||
FeSO4.7H2O | |||
Thiamine.HCl | |||
Pyridoxine.HCl | |||
Glycine | |||
Nicotinic acid | |||
Myo-inositol | |||
Saccharose | |||
MES hydrate | |||
Agar |