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Medicine

Vivo में खरगोश को जीन हस्तांतरण आम मन्या धमनी Endothelium

Published: May 6, 2018 doi: 10.3791/56982
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medicine, University of Washington

Summary

इस विधि को खरगोश मन्या धमनियों के endothelium में एक transgene परिचय है । transgene का परिचय transgene उत्पाद की जैविक भूमिका के मूल्यांकन की अनुमति देता है या तो सामांय धमनियों या रोग मॉडल में । विधि भी डीएनए विनियामक दृश्यों की गतिविधि को मापने के लिए उपयोगी है ।

Abstract

इस विधि का लक्ष्य दोनों खरगोश आम मन्या धमनियों के पृथक खंडों के endothelium में एक transgene परिचय है. विधि फोकल endothelial-चयनात्मक transgenesis प्राप्त करता है, जिससे एक अंवेषक endothelial की जैविक भूमिकाओं-व्यक्त transgenes निर्धारित करने के लिए और बड़ी धमनी में डीएनए दृश्यों की vivo transcriptional गतिविधि में यों तो की अनुमति देता है endothelial कक्ष । विधि खरगोश आम मन्या धमनियों के सर्जिकल अलगाव का उपयोग करता है और एक arteriotomy एक transgene-व्यक्त वायरल वेक्टर में धमनी लुमेन उद्धार करने के लिए । लुमेन में सदिश की एक छोटी गर्मी की अवधि, लुमेन सामग्री के बाद आकांक्षा के साथ, endothelium में transgene की कुशल और टिकाऊ अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है, कोई पता लगाने के transduction या अभिव्यक्ति के बाहर के साथ पृथक धमनी खंड । विधि दोनों सामांय धमनियों में और मानव संवहनी रोग के मॉडल में transgene उत्पादों की जैविक गतिविधियों का आकलन करने की अनुमति देता है, जबकि प्रणालीगत प्रभाव है कि या तो अंय साइटों (उदाहरणके लिए जीन वितरण लक्ष्यीकरण द्वारा कारण हो सकता है परहेज जिगर) या रोगाणु लाइन transgenesis द्वारा endothelium को आनुवंशिक constructs देने के वैकल्पिक दृष्टिकोण से । विधि के आवेदन एक कुशल सर्जन और anesthetist, एक अच्छी तरह से सुसज्जित ऑपरेटिंग कमरे, क्रय और आवास खरगोश की लागत, और जीन स्थानांतरण वेक्टर निर्माण और उपयोग में विशेषज्ञता के लिए की जरूरत के लिए की जरूरत द्वारा सीमित है । इस विधि के साथ प्राप्त परिणामों में शामिल हैं: धमनी संरचना, सेलुलर, extracellular मैट्रिक्स, या vasomotor समारोह में transgene से संबंधित परिवर्तन; बढ़ जाती है या धमनी सूजन में कमी; संवहनी कोशिका apoptosis में परिवर्तन; और प्रगति, मंदता, या intimal हाइपरप्लासिया या atherosclerosis जैसे रोगों के प्रतिगमन । विधि भी देशी और सिंथेटिक डीएनए विनियामक अनुक्रम की क्षमता की माप की अनुमति देता है endothelial कोशिकाओं में transgene अभिव्यक्ति में परिवर्तन, परिणाम है कि शामिल प्रदान: transgene mRNA के स्तर, transgene प्रोटीन के स्तर, और transgene के स्तर एंजाइमी हालचाली.

Introduction

इस विधि के लक्ष्य को खरगोश आम मन्या धमनियों के endothelium में एक transgene परिचय है । transgene का परिचय सामान्य धमनियों में और मानव धमनी रोग के खरगोश मॉडल में transgene उत्पाद की जैविक भूमिका के आकलन की अनुमति देता है । रोग मॉडल में transgene के व्यक्त प्रकट कर सकते है कि transgene (और उसके प्रोटीन उत्पाद) चिकित्सकीय एजेंटों के रूप में वादा दिखाओ1,2,3,4। transgene अभिव्यक्ति कैसेट में सीआईएस एक्टिंग विनियामक तत्वों को शामिल करने से vivo5,6 मेंधमनी endothelium में इन तत्वों की सक्रियता का आकलन सक्षम हो जाता है । विशिष्ट सीआईएस अभिनय नियामक तत्वों की गतिविधि का ज्ञान अधिक सक्रिय अभिव्यक्ति कैसेट डिजाइन करने के लिए और vivo7में बड़ी धमनी endothelium में जीन विनियमन के तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

खरगोश मानव संवहनी शरीर विज्ञान और रोग के विभिंन पहलुओं के लिए एक मूल्यवान मॉडल हैं । खरगोश मनुष्यों के साथ कई संवहनी सुविधाओं का हिस्सा है । उदाहरण के लिए, आधारभूत रक्त मूल्यों, hemostatic विनियमन, और संवहनी अनुदैर्ध्य तनाव खरगोशों और मनुष्यों के बीच समान हैं8. संवहनी रोगों के खरगोश मॉडल सहित कई मानव रोगों की मुख्य विशेषताएं दोहराने: aneurysms (समान ज्यामितीय और प्रवाह विशेषताओं)9, vasospasm (अंतर्वाहिकी उपचार के लिए इसी तरह की प्रतिक्रिया)10,11, और atherosclerosis (लिपिड, मैक्रोफेज में अमीर एक कोर, और एक रेशेदार टोपी में चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं सहित समान सुविधाओं के साथ intimal सजीले टुकड़े)12,13. तदनुसार, खरगोश मॉडल ऐसे घनास्त्रता, vasospasm, धमनीविस्फार, मधुमेह, संवहनी भ्रष्टाचार रोग के रूप में कई संवहनी रोगों के लिए विकसित किया गया है, और atherosclerosis8,13,14, 15,16.

संवहनी शरीर विज्ञान और रोग के पशु मॉडल के बीच चुनने के शोधकर्ताओं के लिए, खरगोश के कई फायदे हैं । कुतर की तुलना में, खरगोशों के बड़े जहाजों आसान शल्य हेरफेर, अंतर्वाहिकी उपकरणों के उपयोग, और मात्रात्मक माप के लिए ऊतक की एक बड़ी राशि की अनुमति देते हैं । खरगोश बहुत करीब है phylogenetically से रहनुमाओं के लिए कर रहे है17कुतर रहे हैं, और नस्ली खरगोशों की अधिक से अधिक आनुवंशिक विविधता मनुष्यों की आनुवंशिक परिवर्तनशीलता को बेहतर अनुमानित । आनुवंशिक विविधता विशेष रूप से नैदानिक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, जो-उनके स्वभाव से-उद्देश्य है कि आनुवंशिक रूप से विविध मानव आबादी के लिए लागू किया जा सकता है चिकित्सा विकसित करने के लिए । कई के साथ के रूप में नहीं तो अंय सभी मॉडल प्रजातियों, खरगोश जीन आसानी से क्लोन या संश्लेषित कर रहे है क्योंकि खरगोश जीनोम उच्च कवरेज (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2] के साथ अनुक्रम किया गया है । अंय बड़े पशु मॉडल (जैसे कुत्तों, सूअर, या भेड़ के रूप में) की तुलना में, खरगोश खरीद और घर के लिए अपेक्षाकृत सस्ती कर रहे है और वे नस्ल और संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं । खरगोशों में विशिष्ट संवहनी रोग मॉडल प्रत्येक मानव रोग के मॉडल है कि इस पांडुलिपि8,12,18के दायरे से बाहर हैं के रूप में अपने स्वयं के फायदे और कमियों है । एक अंवेषक इन लाभों और कमियों की समीक्षा के लिए अगर खरगोश एक विशिष्ट प्रयोगात्मक सवाल का जवाब देने के लिए सबसे अच्छा मॉडल है निर्धारित करना चाहिए ।

vivo में endothelial कोशिकाओं में deoxyribonucleic एसिड (DNA) विनियामक अनुक्रम की शुरूआत एक जटिल शारीरिक वातावरण में इन दृश्यों की गतिविधि की जांच सक्षम बनाता है । इन विट्रो में transfected endothelial कोशिकाओं में अध्ययन डीएनए विनियामक अनुक्रम के प्रारंभिक आकलन के लिए उपयोगी हो सकता है; हालांकि, vivo5,19,20 मेंअध्ययन दोहराया जाता है जब ऊतक संस्कृति मॉडल में अभिव्यक्ति का स्तर कभी नहीं reproduced कर रहे हैं । इन विट्रो में सिस्टम भी प्रोटीन संकेतन और endothelial शरीर क्रिया विज्ञान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संस्कृतिपूर्ण संवहनी कोशिकाओं के बीच संचार के बुनियादी रास्ते की खोज के लिए उपयोगी हो सकता है; हालांकि, और अधिक जटिल रास्ते या विनियामक नेटवर्क है कि पड़ोसी संवहनी कोशिकाओं या प्रतिरक्षा प्रणाली के जटिल आबादी से प्रभावित कर रहे है सबसे अच्छा में एक vivo प्रणाली6,20में अध्ययन कर रहे हैं । यहां वर्णित विधि के साथ या बिना रोग के एक बरकरार पोत के संदर्भ में endothelium में transgene अभिव्यक्ति के विनियमन की खोज के लिए एक मंच प्रदान करता है । vivo में प्रणाली भी शारीरिक और रोग सेलुलर crosstalk की जांच और प्रतिरक्षा प्रणाली के योगदान की पहचान जीन अभिव्यक्ति के विनियमन के लिए परमिट6।

रोगाणु लाइन transgenesis (विशेष रूप से चूहों में) endothelial कोशिकाओं को transgene अभिव्यक्ति निर्देशन के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है । यह तरीका विशिष्ट प्रवर्तक या विनियामक क्षेत्रों21,22द्वारा मध्यस्थता endothelial लक्ष्यीकरण के साथ जीवन-दीर्घ transgene अभिव्यक्ति प्रदान कर सकता है । हालांकि, ट्रांसजेनिक चूहों की पीढ़ी समय लेने वाली और महंगी है, कई ट्रांसजेनिक लाइनों अक्सर वांछित सेल प्रकार और पर्याप्त transgene अभिव्यक्ति स्तर की उपलब्धि के लिए transgene का लक्ष्यीकरण सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए, और प्रयोगात्मक murine प्रणालियों में परिणाम तनाव पर निर्भर हो सकता है । endothelial-लक्षित transgenes के साथ Murine ट्रांसजेनिक मॉडल कई फायदे हैं: transgenesis को प्राप्त करने के क्रम में हर प्रयोगात्मक पशु पर सर्जरी प्रदर्शन करने की कोई जरूरत नहीं है, प्रयोगात्मक चूहों में कई अन्य उपलब्ध ट्रांसजेनिक चूहों के साथ पैदा किया जा सकता है आदेश आनुवंशिक और phenotypic बातचीत का परीक्षण करने के लिए, और वहां एंटीबॉडी की एक विस्तृत चयन कि murine प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया, phenotypes के लक्षण वर्णन की सुविधा है । हालांकि, रोगाणु लाइन के माध्यम से endothelium को transgenes के लक्ष्यीकरण आमतौर पर vasculature भर में transgene अभिव्यक्ति में परिणाम,22 यह मुश्किल साइट है जिस पर transgene उत्पाद अभिनय है निर्धारित करने के लिए कर रही है । यह विशेष रूप से सच है जब transgene उत्पाद स्रावित है, क्योंकि एक transgene उत्पाद vasculature भर में endothelial कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक जानवर के भीतर साइटों के किसी भी संख्या में जैविक गतिविधि हो सकता है । हालांकि विधि इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीकी विशेषज्ञता और विशेष सुविधाओं की आवश्यकता है, यह कम समय लेने वाली और कम एक endothelial-विशिष्ट ट्रांसजेनिक माउस लाइन के विकास से महंगा हो सकता है । यह बड़ी धमनी के एक खंड के endothelial कोशिकाओं में चुनिंदा एक प्रोटीन के समारोह के आकलन के लिए अनुमति देता है, और यह contralateral आम मन्या का उपयोग एक बनती नियंत्रण के रूप में परमिट (प्रणालीगत कारकों को नष्ट करने कि प्रयोगात्मक के बीच भिन्न हो सकते हैं पशु-उदाहरण के लिए, रक्तचाप या कोलेस्ट्रॉल के स्तर-अनियंत्रित चर के रूप में) ।

जीन थेरेपी संवहनी रोगों के उपचार के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है, विशेष रूप से पुराने रोगों, क्योंकि एक भी आवेदन निरंतर या संभवतः जीवन एक चिकित्सीय जीन23की लंबी अभिव्यक्ति प्रदान कर सकते हैं । जीन थेरेपी के चिकित्सकीय वादा दैहिक जीन हस्तांतरण के पशु मॉडलों में पता लगाया गया है, अक्सर जिगर को लक्षित24,25, जो एक अपेक्षाकृत आसान लक्ष्य है क्योंकि कई रक्त जनित वायरल वैक्टर hepatotropic हैं । हालांकि, संवहनी रोग पर एक प्रभाव है, जीन जिगर को लक्षित थेरेपी प्रोटीन के प्रणालीगत एक्सप्रेस प्राप्त करना चाहिए । यह आमतौर पर वेक्टर, जो विषाक्त या भी घातक हो सकता है की बड़ी खुराक की आवश्यकता है26। इसके अलावा, एक प्रोटीन के प्रणालीगत स्तर में वृद्धि बंद लक्ष्य साइड इफेक्ट है, जो जटिल या भी प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या अस्पष्ट सकता है के जोखिम को बढ़ा । स्थानीय जीन endothelium लक्ष्यीकरण संवहनी चिकित्सा के रूप में इस पांडुलिपि में वर्णित प्रणालीगत दुष्प्रभाव से बचने क्योंकि संचार वेक्टर व्यापक रूप से transduced धमनी क्षेत्र से परे नहीं फैलाया जा सकता है, और स्थानीय संवहनी प्रभाव के बिना प्राप्त किया जा सकता है प्रोटीन के प्रणालीगत प्लाज्मा स्तर में परिवर्तन । 27 इसके अलावा, वेक्टर की एक बहुत कम राशि के लिए मजबूत यकृत transduction को प्राप्त करने की जरूरत है की तुलना में एक धमनी खंड transduce की जरूरत है । जिगर से Transgene अभिव्यक्ति के लिए समय के साथ गिरावट की सूचना दी गई है, शायद सेल कारोबार के कारण, दोहराया खुराक की आवश्यकता होती है अगर उच्च स्तर Transgene अभिव्यक्ति को बनाए रखा है । 28 इसके विपरीत, endothelium के कम कारोबार दर चाउ-फेड खरगोशों में कम से ४८ सप्ताह के लिए स्थिर अभिव्यक्ति प्रदान करता है और कोलेस्ट्रॉल से तंग आ चुके खरगोशों के atherosclerotic घावों में सबसे कम 24 हफ्तों के लिए । 1 , 27

यह निर्धारित करने के लिए कि खरगोश आम मन्या endothelium के लिए जीन हस्तांतरण की यह विधि उपयुक्त है, तो फायदे और नुकसान (तालिका 1) विशिष्ट शोध लक्ष्यों के संदर्भ में विचार किया जाना चाहिए । इस विधि के लाभ में शामिल हैं: नस्ल खरगोश मानव आनुवंशिक विविधता के बेहतर प्रतिनिधि से कर रहे है नस्ल चूहों (नैदानिक काम के लिए महत्वपूर्ण); खरगोश आसान हेरफेर और विश्लेषण के लिए और अधिक ऊतक के लिए बड़ा जहाजों प्रदान; विधि endothelium-लक्षित transgene अभिव्यक्ति कहीं अधिक जल्दी से प्राप्त कर सकते है से रोगाणु लाइन endothelial ट्रांसजेनिक चूहों में लक्ष्यीकरण; वेक्टर खुराक आसानी से transgene अभिव्यक्ति के मॉडल चर स्तर को समायोजित किया जा सकता है; बड़ी धमनी endothelium के लिए विशिष्ट प्रक्रियाओं की जांच की जा सकती है; और स्थानीय संवहनी transgenesis विपरीत मन्या एक ही जानवर में एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है, अनियंत्रित चर के रूप में प्रणालीगत कारकों को नष्ट करने. नुकसान में शामिल हैं: विशेष सुविधाओं और विशेषज्ञता की आवश्यकता है; कम आनुवंशिक रूप से संशोधित पृष्ठभूमि, जिस पर प्रयोग करने के लिए चूहों की तुलना में खरगोश में उपलब्ध हैं; और वहाँ माउस प्रोटीन बनाम खरगोश के लिए एंटीबॉडी का एक कम व्यापक चयन है (transgene प्रोटीन और अन्य एंटीजन कि प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या में महत्वपूर्ण हो सकता है की immunodetection के लिए).

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Protocol

सभी विधियां यहां वर्णित विश्वविद्यालय के वाशिंगटन कार्यालय के पशु कल्याण और संबद्ध संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के द्वारा अनुमोदित किया गया है, और सभी प्रासंगिक विनियामक और संस्थागत के अनुरूप और अनुपालन में पूरा किया गया दिशानिर्देश.

नोट: खरगोश आम मन्या धमनियों के लिए जीन हस्तांतरण एक anesthesiologist या सहायक की सहायता के साथ एक सर्जन द्वारा खरगोशों पर किया जाता है.

1. खरगोश आम मन्या धमनियों को जीन हस्तांतरण: पूर्व ऑपरेशन

  1. खरगोश को Anesthetize । खरगोश वजन । एक सिरिंज में 30 मिलीग्राम/kg ketamine और 2 मिलीग्राम/kg xylazine का मिश्रण करें । ketamine/xylazine इंट्रामस्क्युलर (आईएम) paraspinous मांसपेशियों में संज्ञाहरण पैदा करने के लिए सुई ।
  2. जबकि खरगोश anesthetized बनने के लिए प्रतीक्षा कर रहा है, तैयारी कक्ष और संचालन कक्ष (या) टेबल तैयार करते हैं ।
    1. या तैयारी कक्ष में: नेत्र मरहम और तैयारी तालिका की पहुंच के भीतर fentanyl पैच प्लेस; बाल कतरनी और खरगोश की गर्दन और कान शेविंग के लिए एक निर्वात सेट; एक अलग सेट एक शराब तैयारी पैड, एक 24G एक्स ¾ "कैथेटर, एक इंजेक्शन बंदरगाह, और शल्य टेप के लिए खरगोश कान नस में नसों में लाइन (IV) सुरक्षित ।
    2. में या: निगरानी उपकरणों की स्थापना की और स्थिति की जांच [इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईकेजी), ऑक्सीजन संतृप्ति (एसपीओ2), तापमान] या मेज पर; ऑक्सीजन और isoflurane तैयार; चेहरा मुखौटा के लिए धुंध पट्टी टाई खरगोश को सुरक्षित और मेज के सिर के अंत पर मुखौटा जगह है ।
      नोट: चेहरे मास्क पर बंधे धुंध स्ट्रिप्स के बारे में ४५ सेमी प्रत्येक की 2 पूंछ होना चाहिए ।
    3. या मेज पर वार्मिंग पानी कंबल पर बारी । पानी कंबल के शीर्ष पर, गर्दन का समर्थन और एक dispersing इलेक्ट्रोड प्लेट के लिए एक लुढ़का तौलिया की स्थिति (बाद में खरगोश की पीठ के नीचे रखा) ।
    4. एक 18-19G सुई संलग्न के साथ एक खारा चतुर्थ बैग के १०० मिलीलीटर के साथ या चतुर्थ पंप की स्थापना की और प्रवाह की दर सेट करने के लिए 10 मिलीलीटर/
    5. lidocaine एचसीएल के 1 मिलीलीटर (2% शेयर समाधान) और bupivicaine एचसीएल के 1 मिलीलीटर (०.५% स्टॉक समाधान) एक सिरिंज में गठबंधन, एक स्थानीय एनाल्जेसिक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
  3. जब खरगोश पूरी तरह से anesthetized है, सर्जरी के लिए खरगोश तैयार करते हैं ।
    नोट: एक पेडल पलटा की कमी के लिए जाँच करें (एक पैर की अंगुली चुटकी; अंग वापसी के लिए देखो) संवेदनाहारी गहराई सुनिश्चित करने के लिए, और सर्जरी के दौरान पेडल पलटा निगरानी करने के लिए जारी.
    1. आंखों के लिए नेत्र मरहम लागू करें । निचली पूर्वकाल पेट (ऊपर मलाशय) पर दस्ताने उंगलियों के साथ दबाकर और गुदा की ओर उंगलियां चलती द्वारा खरगोश के मलाशय से मल निकालें । यह एक गुदा तापमान जांच के बाद में नियुक्ति के लिए अनुमति देगा ।
    2. इस क्षेत्र को साफ रखने के लिए एक निर्वात का उपयोग करते हुए mandible के किनारे करने के लिए स्टर्नल पायदान से पूर्वकाल गर्दन दाढ़ी । इसके अलावा चतुर्थ स्थान और fentanyl पैच लगाव के लिए दोनों कान दाढ़ी, और नाड़ी-oximetry जांच के लिए एक बाएं रियर मध्य पैर की अंगुली दाढ़ी ।
      नोट: प्रोटोकॉल मानता है कि सर्जन पूरी प्रक्रिया के लिए खरगोश के दाईं ओर है । यदि या सेटअप सर्जन विपरीत पक्ष पर रखता है, इस कदम में रिवर्स पक्षों तारों और सर्जन के चतुर्थ विपरीत रखने के लिए । भविष्य के कदमों की ओर भी आवश्यकतानुसार स्विच किया जाना चाहिए.
    3. एक शराब तैयारी पैड के साथ छोड़ दिया कान पोंछना, बाएं कान की नस में एक 24G चतुर्थ कैथेटर जगह, इंजेक्शन बंदरगाह के साथ टोपी, और यह सुरक्षित करने के लिए खरगोश के कान को कैथेटर/बंदरगाह टेप । खरगोश के दाहिने कान के लिए एक fentanyl पैच (25 µ g/ज) लागू करें ।
    4. या तो बस सिर के नीचे खरगोश की गर्दन के नीचे एक लुढ़का गर्दन समर्थन तौलिया के साथ ऑपरेटिंग मेज पर या जगह लापरवाह में खरगोश परिवहन । धीरे खरगोश की गर्दन का विस्तार जब तक यह सीधे और लगभग क्षैतिज है ।
    5. खरगोश हुक 1 L/मिनट पर पर हे2 के साथ चेहरे मास्क करने के लिए, और isoflurane प्रशासन शुरू करते हैं । धुंध खरगोश के तहत गर्दन का समर्थन तौलिया के आसपास मुखौटा से बंधा पट्टी के सिरों लपेटकर मुखौटा सुरक्षित । प्रक्रिया के शेष के लिए उचित संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए (दिल की दर, श्वसन दर, और पेडल पलटा के आधार पर) की जरूरत के रूप में (आमतौर पर 1-2%) isoflurane समायोजित करें ।
    6. यह सुनिश्चित करें कि फैलाव इलेक्ट्रोड प्लेट खरगोश की पीठ के नीचे केंद्रित है । तापमान और पल्स-oximeter जांच प्लेस और खरगोश के लिए ईकेजी सुराग लागू होते हैं ।
    7. खरगोश के कान में कैथेटर बंदरगाह के लिए ऊपर चतुर्थ खारा हुक, 10 मिलीलीटर पर खारा पंप शुरू/
      नोट: 1 ज के बाद खारा पम्प 5 एमएल/एच प्रति किग्रा तक कम किया जा सकता है ।
    8. ढीले से उन्हें मेज पर बांधकर खरगोश के सामने पैरों को नियंत्रित करें । वैकल्पिक रूप से, खरगोश को छाती के अधीन किया जा रहा है से खरगोश की रक्षा के लिए एक छोटे प्लास्टिक की मेज जगह/खरगोश की छाती पर झुकाव सर्जन से पेट दबाव/
      नोट: छोटी मेज पेट की सामग्री की मजबूर regurgitation को रोकने में मदद कर सकते हैं ।
    9. पहले से तैयार lidocaine के 2 मिलीलीटर (2% स्टॉक)/bupivacaine (०.५% स्टॉक) (50/50 मिश्रण) स्थानीय संज्ञाहरण के लिए योजना बनाई गर्दन चीरा लाइन के साथ चमड़े के इंजेक्शन ।
    10. सहायक chlorhexidine और isopropanol के 3 बारी सफ़ाई के साथ शल्य साइट तैयार करते हैं, और फिर betadine साथ एक स्प्रे । हाथ धोने, गाउन, और दस्ताने, उचित अपूतित तकनीक के बाद ।
      नोट: शल्य चिकित्सा के पहले आधे के साथ सहायता करने के लिए सर्जन 2x शल्य loupes पहने होना चाहिए । अस्तित्व सर्जरी के दौरान यह सर्जन और सर्जिकल क्षेत्र की बाँझ बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । केवल सहायक किसी भी गैर बाँझ वस्तुओं को संभालना चाहिए, और निष्फल सामग्री सर्जन को पारित कर दिया या लिपटी साधन तालिका पर रखा aseptically होना चाहिए. बाँझ तौलिए इस तरह माइक्रोस्कोप के रूप में गैर बाँझ उपकरण हेर-फेर, जबकि बांझपन बनाए रखने के लिए सर्जन द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है ।

2. जीवन रक्षा सर्जरी (जीन अंतरण)

  1. उपकरणों और बाँझ क्षेत्र तैयार करते हैं ।
    1. सहायक एक मेज कपड़े, खरगोश के लिए एक कागज कपड़ा, और कई तौलिए युक्त बाँझ कपड़ा पैक खुला चलो । Aseptically सर्जन के लिए मदों स्थानांतरण ।
    2. साधन तालिका कपड़ा । 6 बाँझ तौलिए और लिपटी मेज पर कागज कपड़े प्लेस ।
    3. 4 तौलिए के साथ, खरगोश गर्दन कपड़े, केवल शल्य साइट उजागर छोड़कर (लगभग 4 सेमी x 10 सेमी) । खरगोश पर कागजी कपड़ा रखना ।
    4. सहायक निष्फल साधन पैक और जगह साधन मेज पर aseptically को खोलने दें ।
    5. सहायक निम्नलिखित उपकरण और aseptically जगह उपकरण मेज या सर्जन को हाथ पर खुला चलो: तीन 1-एमएल सीरिंज (और एक सुई अगर सीरिंज सुई के साथ पहले से ही भरी हुई नहीं हैं), १ २० मिलीलीटर सिरिंज, एक 21G सुई, एक 19G सुई, 3-0 polyglycolic एसिड (पीजीए) टांका, 5-0 पीजीए सीवन, 7-0 टांक, और दो 24G IV-कैथेटर ।
    6. ७.२५ "Kantrowitz संदंश का उपयोग कर खरगोश कपड़ा को electrocautery केबल सुरक्षित और फिर तालिका के बंद प्लग अंत ड्रॉप. सहायक electrosurgery इकाई के लिए केबल कनेक्ट और बिजली चालू करने दें ।
    7. भरें एक 20 बाँझ खारा के साथ सिरिंज, एक चतुर्थ बैग या शीशी सहायक द्वारा आयोजित से तैयार की । इस खारा का प्रयोग प्रक्रिया के दौरान उजागर ऊतक नम रखने की जरूरत के रूप में ।
    8. एक 1 मिलीलीटर Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM, धमनी धोने के लिए) के 1 मिलीलीटर के साथ सिरिंज तैयार करें । प्रत्येक मन्या धमनी कि transduced हो जाएगा के लिए, पतला वायरस के ०.३५ मिलीलीटर की जरूरत है । यदि एक ही वायरस दोनों पक्षों के लिए प्रयोग किया जाता है, एक 1 मिलीलीटर DMEM में पतला ०.७ मिलीलीटर की मात्रा के वायरस के साथ सिरिंज तैयार । विभिन्न पक्षों विभिन्न वायरस प्राप्त कर रहे हैं, तो [उदाहरण के लिए एक "नल" वायरस नियंत्रण एक तरफ], दो 1 मिलीलीटर सीरिंज तैयार, वायरस समाधान के ०.३५ मिलीलीटर के साथ प्रत्येक. सहायक-निर्भर एडीनोवायरस के लिए, वायरस एकाग्रता है 2 x 1011 वायरल कणों (वीपी)/mL.
      नोट: सहायक वायरस तैयार करते हैं । सर्जन बाँझ सिरिंजों में DMEM और वायरस निलंबन ऊपर खींचता है.
    9. एक छेद में कपड़े कट । छेद का आकार खरगोश की गर्दन है कि कदम 2.1.3 में तौलिए से तैयार है पर शल्य साइट के रूप में एक ही आकार का होना चाहिए । अंतर्निहित तौलिए कि तौलिया clamps के साथ खरगोश की गर्दन पर लिपटी है के लिए कागज के कपड़े में छेद के कोनों दबाना ।
  2. आम मन्या धमनियों को अलग.
    नोट: इस भाग के लिए 2x सर्जिकल loupes इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    1. midline के साथ एक electrocautery के साथ त्वचा में कटौती लगभग 7-9 सेमी mandible की ओर कपाल का विस्तार और तौलिया clamps के साथ खुले त्वचा दबाना ।
    2. caudal अंत में electrocautery के साथ प्रावरणी के माध्यम से एक छोटा पार्श्व कट बनाओ । फिर कट में बड़ी कैंची डालें और पूरी midline के साथ प्रावरणी को कुंद काटना । electrocautery के साथ midline के नीचे से कटे हुए विदारक प्रावरणी को काट लें ।
    3. छोटे विदारक कैंची के साथ, वी के आकार की मांसपेशियों के बीच काटना (sternocephalic मांसपेशी) और श्वासनली पर sternohyoid मांसपेशी, आम मन्या धमनियों को बेनकाब करने के लिए, दाईं ओर शुरू.
    4. काटना सही आम मन्या धमनी के आसपास के ऊतकों से मुक्त, सभी शाखाओं विभाजित, गर्दन caudally के आधार से ग्रसनी तंत्रिका कपाल के पार करने के लिए. विच्छेदन के दौरान धमनी को वापस लेने में सहायता करने के लिए सर्जिकल सिलिकॉन छोरों का उपयोग करें ।
      ध्यान दें: देखभाल या तो vagus तंत्रिका कि आम मन्या, या छोटे नसों कि आम मन्या पर पार करने के लिए समानांतर चलाता है परेशान नहीं करने के लिए लिया जाना चाहिए ।
    5. Ligate आम मन्या धमनी बंद आने वाली किसी भी बड़ी शाखाओं (प्रति पक्ष 1-2) के साथ 5-0 रेशम टांके से पहले शाखा को काटने के लिए लंबी मन्या के 4-5 सेमी खंड मुक्त करने के लिए । कट ligated शाखाओं से 1-2 mm दूर टाई ताकि टाई बंद पर्ची नहीं है ।
    6. बाईं ओर (steps 2.2.3-2.2.5) पर विच्छेदन दोहराएँ ।
  3. आम मन्या धमनियों में वैक्टर संचार ।
    नोट: एक शल्य माइक्रोस्कोप (16X) arteriotomy प्रदर्शन के लिए आवश्यक के रूप में प्रयोग किया जाता है, वेक्टर infusing/नियंत्रण समाधान, और arteriotomy मरंमत ।
    1. सहायक शल्य loupes सर्जन से हटाने और शल्य माइक्रोस्कोप की स्थिति में ले जाने के लिए । खुर्दबीन पर एक बाँझ तौलिया कपड़ा बाँझ क्षेत्र दूषित बिना माइक्रोस्कोप के हेरफेर की अनुमति देने के लिए.
    2. हेपरिन [१५० अंतर्राष्ट्रीय इकाइयों (IU)/kg] में चतुर्थ कैथेटर इंजेक्षन और खारा के 10 मिलीलीटर के साथ फ्लश ।
    3. अलग सही आम मन्या के लिए रिटर्निंग, जुटाए मन्या खंड के मध्य भाग के आसपास दो रेशम संबंध रखो और उन्हें कस के बिना प्रत्येक पर एक ही हाथ गांठ टाई.
    4. बस बेवल के ऊपर 19G सुई मोड़ लगभग ८० डिग्री बड़ी सुई चालक का उपयोग कर (बेवल मोड़ नहीं; चित्र 1) ।
    5. संवहनी क्लिप के साथ अलग खंड के प्रत्येक छोर पर धमनी दबाना, कपाल क्लिप पहले धमनी भरने के लिए अनुमति देने के लिए, और फिर caudal क्लिप रखने ।
    6. caudal संवहनी क्लिप के लिए तुला 19G सुई बस कपाल के साथ आम मन्या धमनी पंचर, महान देखभाल करने के लिए वापस या साइड दीवारों पंचर नहीं ले । लुमेन में सुई टिप अग्रिम और यह सुनिश्चित करें कि arteriotomy पूरी तरह से धमनी की दीवार को ट्रैवर्स करने के लिए दो बार वापस ले लो । फिर ध्यान से सुई वापस ले ।
      नोट: यह एक arteriotomy है कि धमनी की दीवार के सभी परतों को साफ करने में प्रवेश बनाने के लिए महत्वपूर्ण है और धमनी की दीवार काटना नहीं है (adventitia और मीडिया के माध्यम से अक्षीय रूप से गुजर रहा है) । इस को पूरा करने के लिए, मन्या सुई धमनी की दीवार के खिलाफ एक ९० ° कोण के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में तैनात टिप के साथ पंचर होना चाहिए (चित्रा 1). मन्या पंचर एक ९० ° कोण पर ठीक संदंश के साथ adventitia द्वारा धमनी हथियाने से सहायता प्राप्त है और धीरे से धमनी की सतह उठाने जबकि सुई की नोक बस लिफ्ट बिंदु करने के लिए caudal दबाने । इस युद्धाभ्यास में पीछे की दीवार (चित्रा 1) से टकराने का खतरा भी कम हो जाता है ।
    7. मोड़ो और एक घोंसला है जिस पर सुई लेनी के लिए इस्तेमाल किया सिरिंज रखना करने में कई धुंध पैड ऊपर । खरगोश की छाती पर घोंसला caudal चीरा लगाने के लिए रखें ।
    8. DMEM-केवल (भी तंग नहीं) शामिल है कि सिरिंज पर एक चतुर्थ कैथेटर रखो और इस टिप से कैथेटर ~ 4 मिमी झुकना इतना है कि मोड़ के बारे में ७५ डिग्री पर रखती है के बाद यह जारी है ।
    9. चतुर्थ डालें-मोड़ बिंदु तक धमनी में कैथेटर और DMEM के साथ धमनी से सभी रक्त बाहर धोने (~ ०.२५ एमएल एक्स 2) । प्रत्येक धोने के लिए, DMEM के साथ धमनी को भरने, और फिर धीरे से एक दस्ताने उंगली के साथ धमनी पर दबाकर पोत लुमेन से अवशिष्ट DMEM को हटाने, सिर्फ कपाल संवहनी क्लिप करने के लिए caudal शुरुआत. कोमल दबाव बनाए रखते हुए उंगली को कपाल से caudal तक स्लाइड करें । चमकदार सामग्री arteriotomy के माध्यम से बाहर धोने जाएगा ।
    10. धमनी में कैथेटर रखें और वायरस समाधान युक्त सिरिंज के लिए DMEM सिरिंज विनिमय. सुनिश्चित करें कि कोई हवा कैथेटर में प्रवेश करती है ।
    11. ताकि वे कैथेटर टिप के स्थान पर धमनी के चारों ओर, लेकिन उंहें कस नहीं है धमनी नीचे रेशम संबंधों स्लाइड ।
    12. वायरस के समाधान के ०.०३ मिलीलीटर फ्यूज कैथेटर से बाहर शेष DMEM धक्का और फिर धमनी खाली । यह फिर से एक उंगली, कपाल caudal के साथ लुमेन से सभी तरल पदार्थ को हटाने (के रूप में कदम 2.3.9 में) ।
    13. लुमेन सील करने के लिए कैथेटर टिप के आसपास दो संबंधों को कसने । वायरस समाधान (~ ०.२५ एमएल; 2 एक्स 1011 वीपी/एडीनोवायरस के लिए) के लिए धीरे सिरिंज गोताख़ोर दबाकर जब तक धमनी शारीरिक कैलिबर के लिए विवृत्त किया जाता है ।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि धमनी शारीरिक क्षमता को फैलता है और वायरस के अर्क के दौरान विवृत्त रहता है । यदि नहीं, तो जीन हस्तांतरण की डिग्री काफी छोड़ देंगे ।
    14. धीरे से धुंध के घोंसले पर सिरिंज रखना ।
    15. आम मन्या adventitia बस कपाल संवहनी क्लिप के caudal जीन transduction के कपाल सीमा को चिह्नित करने में एक 7-0 के लिए टांका लगाएं
    16. वायरस युक्त समाधान के बाद 20 मिनट के लिए धमनी लुमेन में किया गया है, वायरस से युक्त सिरिंज को हटाने और यह एक खाली सिरिंज के साथ प्रतिस्थापित. महाप्राण वायरस से युक्त समाधान धीरे जब तक पोत गिर और सिरिंज हटा दें । कट या रेशम संबंधों को पूर्ववत और धीरे कैथेटर निकालें ।
      नोट: उंहें हटाने में संबंधों को बहुत ही कम एड्स काटना । मन्या endothelium के लिए क्षति के कारण से बचने के लिए सावधानी से निकालें कैथेटर ।
    17. सर्जिकल माइक्रोस्कोप का प्रयोग, 7-0 के साथ arteriotomy बंद एक एक्स पैटर्न (चित्रा 2) का उपयोग कर ।
      1. arteriotomy के नीचे-दाईं और नीचे-बाईं ओर के पोत से बाहर निकलने पर पहले से पास में प्रवेश करना । इसके बाद ओपनिंग को क्रॉस करें और टॉप-राइट से ऊपर-बाएं से दूसरी पास बनाएं ।
      2. नीचे सीवन बांधने से पहले, बहुत संक्षेप में कपाल संवहनी क्लिप जारी करके धमनी फ्लश । रक्त arteriotomy से बाहर प्रवाह होगा जब क्लिप जारी की है, लुमेन से हवा और अवशिष्ट वायरस को हटाने ।
      3. धीरे arteriotomy बंद करें और 2 वर्ग समुद्री मील के साथ एक सीवन टाई करने के लिए सीवन खींचो ।
        नोट: सीवन खींच बहुत तंग ऊतक कि प्रवाह परेशान करेंगे के गुच्छन कारण होगा, घनास्त्रता जोखिम में वृद्धि और परिवर्तन प्रवाह जो रोग मॉडल में एक महत्वपूर्ण अनियंत्रित चर हो सकता है ।
    18. कपाल संवहनी क्लिप रिलीज, और फिर caudal संवहनी क्लिप किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए धुंध के साथ प्रकाश दबाव का उपयोग कर । यदि रक्तस्राव बनी रहती है, 1-2 मिनट के लिए दबाव जारी रखें । यदि arteriotomy को ठीक से बंद कर दिया गया तो रक्तस्राव इस समय सीमा के भीतर हमेशा बंद हो जाता है ।
    19. चलो सहायक इंजेक्षन buprenorphine [०.०२ मिलीग्राम/kg; चमड़े के नीचे (वर्ग)] के बारे में इस समय पश्चात analgesia प्रदान करने के लिए जब तक fentanyl प्लाज्मा स्तर चिकित्सकीय हो ।
      नोट: एक दूसरा buprenorphine इंजेक्शन (०.०२ मिलीग्राम/ वर्ग) पहले इंजेक्शन के बाद 6 ज की जरूरत हो सकती है जब तक fentanyl प्लाज्मा स्तर चिकित्सकीय बन analgesia बनाए रखने के लिए ।
    20. दोहराएँ वायरस अर्क प्रोटोकॉल बाईं ओर निम्न चरणों का पालन 2.3.2-2.3.19.
  4. घाव बंद
    1. एक 5-0 पीजीए सीवन का प्रयोग करें एक सतत सीवन के साथ midline प्रावरणी बंद करने के लिए ।
    2. एक 3-0 पीजीए सीवन के साथ, एक intradermal दोनों सिरों पर एक दफन गांठ का उपयोग कर पैटर्न के साथ त्वचा को बंद करें ।
  5. पोस्ट-ऑपरेटिव रिकवरी और क्लीनअप ।
    नोट: खरगोश उचित ऑक्सीजन और शरीर के तापमान के लिए लगातार निगरानी की जानी चाहिए, जबकि संज्ञाहरण से उबरने । वसूली एक शांत, शांत वातावरण में जगह ले जाना चाहिए ।
    1. isoflurane और ऑक्सीजन प्रवाह बंद करें और खरगोश से चेहरा मुखौटा हटा दें ।
    2. चतुर्थ तरल पदार्थ हुक लेकिन आपातकालीन चतुर्थ प्रवेश के लिए जगह में चतुर्थ बंदरगाह छोड़ दें ।
    3. वसूली क्षेत्र के लिए खरगोश ले लो और एक वार्मिंग पानी कंबल चालू (या वैकल्पिक रूप से एक बै् गले हीटर) के साथ एक पिंजरे में अपनी तरफ रखना ।
    4. जब तक एसपीओ2 स्थिर है तब तक मास्क द्वारा ओ2 दें ।
    5. खरगोश एक पिंजरे में ठीक हो जाओ, यह दूसरी तरफ हर 15 मिनट के flipping, जब तक खरगोश अपने पिछले पैरों पर बैठ सकते है और चारों ओर ले जाएं ।
    6. जब खरगोश मोबाइल है तो पिंजरे में लौटने से पहले उसके कान से कबसे निकाल दें ।
      नोट: जब तक यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है अन्य जानवरों की कंपनी के लिए खरगोश वापस नहीं है ।
  6. कुछ भी है कि वेक्टर के साथ संपर्क किया था के निपटान या ऑपरेटिव क्षेत्र में था, उचित और sharps अपशिष्ट प्रोटोकॉल निंनलिखित ।

3. खरगोश आम मन्या धमनियों को जीन हस्तांतरण: पोस्ट ऑपरेटिव केयर

  1. खरगोश की कुल हालत का आकलन सर्जरी के बाद दैनिक, घाव भरने के लिए जाँच, संक्रमण के सबूत, भूख, श्वसन, और दर्द के संकेत.
    1. खरगोश के कान की स्थिति की जांच करें (कान नीचे दर्द या संकट का संकेत हो सकता है, खासकर जब एक गंदा उपस्थिति के साथ युग्मित) । जांच करें कि खरगोश मोबाइल और सक्रिय रहता है । stridor बिना सामान्य श्वसन के लिए खरगोश की जाँच करें । जांच करें कि घाव साफ है, शुष्क और बरकरार है । एक सामांय शरीर के तापमान के लिए खरगोश की जांच करें । पशु चिकित्सा सेवाओं से परामर्श अगर खरगोश मोबाइल और सक्रिय नहीं है, सामान्य शरीर के तापमान के साथ, एक साफ उपस्थिति, एक स्वच्छ घाव, और सामान्य श्वसन ।
    2. सामांय भोजन के सेवन और ताजा मल और मूत्र के सबूत के लिए जांच करें ।
      नोट: भोजन का सेवन सर्जरी के बाद कम हो सकता है, लेकिन 2 दिनों के भीतर सामान्य करने के लिए वापस जाना चाहिए; आवश्यकतानुसार पूरक भोजन उपलब्ध कराएं ।
  2. पोस्ट-ऑपरेटिव दिवस 3 पर fentanyl पैच को हटा दें ।
    नोट: Buprenorphine fentanyl पैच द्वारा प्रबंधित नहीं है कि पोस्ट ऑपरेटिव दर्द के लिए आवश्यक के रूप में प्रशासित किया जा सकता है, या मामले में fentanyl पैच जल्दी हटा दिया जाता है.

4. टर्मिनल हार्वेस्ट सर्जरी: पूर्व ऑपरेशन

  1. खरगोश को Anesthetize । १.३ वर्गों और उपलब्धि और संज्ञाहरण के रखरखाव के बारे में 1.3.5 देखें ।
    1. खरगोश वजन । एक सिरिंज में 30 मिलीग्राम/kg ketamine और 2 मिलीग्राम/kg xylazine का मिश्रण करें । paraspinous मांसपेशियों में संज्ञाहरण पैदा करने के लिए ketamine/xylazine IM इंजेक्षन ।
  2. तैयारी कमरे और या टेबल तैयार करते समय खरगोश anesthetized बनने के लिए इंतज़ार कर रहे ।
    1. में या तैयारी कक्ष: सेटअप बाल कतरनी और खरगोश गर्दन और कान शेविंग के लिए एक निर्वात ।
    2. ऑपरेटिंग कमरे में: सेटअप निगरानी उपकरण और स्थिति जांच (एसपीओ2, तापमान) या मेज पर; ऑक्सीजन और isoflurane तैयार; चेहरा मुखौटा के लिए एक धुंध पट्टी टाई खरगोश को सुरक्षित और मेज के सिर के अंत पर मुखौटा जगह है ।
      नोट: धुंध facemask पर बंधे स्ट्रिप्स के बारे में ४५ सेमी प्रत्येक की 2 पूंछ होना चाहिए ।
    3. या मेज पर वार्मिंग पानी कंबल पर बारी । पानी कंबल के शीर्ष पर, गर्दन का समर्थन और एक dispersing इलेक्ट्रोड प्लेट के लिए एक लुढ़का तौलिया की स्थिति (बाद में खरगोश की पीठ के नीचे रखा) ।
    4. lidocaine एचसीएल के 1 एमएल (2% स्टॉक) और bupivicaine एचसीएल के 1 एमएल (०.५% शेयर) (50/50 मिश्रण) एक सिरिंज के रूप में एक स्थानीय एनाल्जेसिक के रूप में संयोजित करें ।
  3. जब खरगोश पूरी तरह से anesthetized है, सर्जरी के लिए खरगोश तैयार करते हैं ।
    1. मलाशय से मल निकालें, जैसा कि 1.3.1 में वर्णित है, एक तापमान जांच के बाद के स्थान के लिए अनुमति देने के लिए ।
    2. क्षेत्र को साफ रखने के लिए एक निर्वात का उपयोग करते हुए mandible के कोण करने के लिए स्टर्नल पायदान से खरगोश दाढ़ी । इसके अलावा पल्स-oximetry जांच के लिए बाएं रियर मध्य पैर की अंगुली दाढ़ी ।
      नोट: प्रोटोकॉल मानता है कि सर्जन खरगोश के दाईं ओर हो जाएगा । यदि या सेटअप विपरीत पक्ष पर सर्जन जगह होगी, इस कदम में रिवर्स पक्षों सर्जन के विपरीत तारों रखने के लिए । भविष्य के कदमों की ओर भी आवश्यकतानुसार स्विच किया जाना चाहिए.
    3. या तो बस सिर के नीचे खरगोश की गर्दन के नीचे एक लुढ़का गर्दन समर्थन तौलिया के साथ ऑपरेटिंग मेज पर या जगह लापरवाह में खरगोश परिवहन । धीरे खरगोश की गर्दन का विस्तार जब तक यह सीधे और लगभग क्षैतिज है ।
    4. खरगोश हुक अप करने के लिए 1 L/मिनट पर हे2 के साथ मास्क का सामना करने के लिए, और isoflurane प्रशासन शुरू करते हैं । धुंध खरगोश के तहत गर्दन का समर्थन तौलिया के आसपास मुखौटा से बंधा पट्टी के सिरों लपेटकर मुखौटा सुरक्षित । समायोजित isoflurane (आमतौर पर 1-2%) के रूप में प्रक्रिया के शेष के लिए उचित संज्ञाहरण बनाए रखने की जरूरत है ।
    5. यह सुनिश्चित करें कि फैलाव इलेक्ट्रोड प्लेट खरगोश की पीठ के नीचे केंद्रित है । स्थान पर तापमान और नाड़ी-oximeter की जांच की जाए ।
    6. ढीले से उन्हें मेज पर बांधकर खरगोश के सामने पैरों को नियंत्रित करें ।
      ध्यान दें: वैकल्पिक, खरगोश पर एक छोटे से प्लास्टिक की मेज पर जगह के लिए छाती के अधीन किया जा रहा है/खरगोश के सीने पर झुकाव सर्जन से पेट दबाव/ यहां लक्ष्य उदर सामग्री की मजबूर regurgitation को रोकने के लिए है ।
    7. lidocaine के 2 मिलीलीटर सुई (2% स्टॉक समाधान)/bupivacaine (०.५% शेयर समाधान) (50/50 मिश्रण; से कदम २.४) स्थानीय संज्ञाहरण के लिए नियोजित गर्दन चीरा लाइन के साथ चमड़े के नीचे ।
    8. betadine साथ सर्जिकल साइट स्प्रे । सर्जिकल प्रक्रिया के लिए साफ दस्ताने पर रखो ।

5. टर्मिनल सर्जरी (पोत फसल)

  1. उपकरणों और सर्जिकल क्षेत्र तैयार करते हैं ।
    1. एक साफ कपड़े एक मेज कपड़े और खरगोश के लिए एक कागज कपड़ा युक्त पैक खोलें । साधन तालिका कपड़ा ।
    2. साधन पैक, साधन मेज पर जगह खोलें, और उपकरणों की व्यवस्था । साधन मेज पर निंनलिखित उपकरण प्लेस: १ २० मिलीलीटर सिरिंज, और एक 21G सुई ।
    3. सुरक्षित खरगोश ७.२५ "Kantrowitz संदंश का उपयोग कर कपड़े को electrocautery केबल । electrosurgery इकाई के लिए प्लग कनेक्ट और इसे चालू करें ।
    4. बाँझ खारा के साथ एक 20 मिलीलीटर सिरिंज भरें । इस खारा का प्रयोग करने के लिए प्रक्रिया के दौरान उजागर ऊतक नम रखने की जरूरत है ।
    5. खरगोश पर कागज कपड़े प्लेस और खरगोश की गर्दन पर शल्य साइट पर कपड़े में एक छेद में कटौती । जगह में तौलिया clamps के साथ खरगोश की त्वचा के लिए छेद के कोनों दबाना ।
  2. आम मन्या धमनियों को अलग.
    नोट: इस भाग के लिए 2x सर्जिकल loupes इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    1. midline के साथ एक electrocautery के साथ त्वचा में कटौती लगभग 7-9 सेमी mandible की ओर कपाल और दबाना त्वचा तौलिया clamps के साथ खुला ।
      नोट: अगर फसल पिछले सर्जरी के बाद केवल कुछ ही दिनों में है, electrocautery की जरूरत नहीं है । बस टांके में कटौती और धीरे से पिछले सर्जरी से चीरा खोलने खींचो ।
    2. caudal अंत में एक electrocautery के साथ प्रावरणी के माध्यम से एक छोटा पार्श्व कट बनाओ । फिर कट में बड़ी कैंची डालें और पूरी midline के साथ प्रावरणी को कुंद काटना । electrocautery के साथ midline के नीचे कटे हुए विदारक प्रावरणी को काट लें ।
    3. छोटे विदारक कैंची के साथ, काटना के बीच वी के आकार की मांसपेशियों (sternocephalic मांसपेशी) और श्वासनली पर sternohyoid मांसपेशी, आम मन्या धमनियों को अलग करने के लिए, सही पक्ष पर शुरू.
    4. काटना गर्दन caudally के आधार से आसपास के ऊतकों से मुक्त ग्रसनी तंत्रिका कपाल के पार करने के लिए सही धमनी । विच्छेदन के दौरान धमनी को वापस लेने में सहायता करने के लिए सर्जिकल सिलिकॉन छोरों का उपयोग करें ।
    5. बाईं ओर (steps 5.2.3-5.2.4) पर विच्छेदन दोहराएँ ।
    6. एक 3-0 रेशम सीवन के साथ, खंड है कि सदिश के साथ संचार किया गया था के लिए आम मन्या धमनी कपाल ligate (उपयोग adventitial पहले सर्जरी में रखा सीवन वेक्टर अर्क के कपाल हद का पता लगाने के लिए । फिर ligate से मन्या caudal को बदलवाने arteriotomy.
    7. ligations के बीच मन्या खंड आबकारी, और खारा के साथ लुमेन फ्लश. दूर पोत से अतिरिक्त adventitial ऊतक ट्रिम और अलग समापन बिंदु विश्लेषण के लिए छोटे टुकड़ों में मन्या खंड काट (प्रोटोकॉल, डीएनए, ribonucleic एसिड (आरएनए), प्रोटीन, explant संस्कृति, आदि).
    8. euthanize करने के लिए Beuthanasia IV के 1 मिलीलीटर सुई, और खरगोश की इच्छामृत्यु की पुष्टि करें ।
  3. कुछ भी है कि वेक्टर के साथ संपर्क किया था के निपटान या ऑपरेटिव क्षेत्र में था, उचित और sharps अपशिष्ट प्रोटोकॉल निंनलिखित ।

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Representative Results

विश्वास के साथ इस पद्धति को कार्यान्वित करने के लिए प्रारंभिक प्रयोगों को यह स्थापित करने के लिए आवश्यक है कि संचालक कुशल और reproducible जीन अंतरण प्राप्त करें, मुख्य रूप से चमकीले endothelial कोशिकाओं में transgene अभिव्यक्ति के साथ. हमारे अनुभव में, यह सबसे आसानी से एक सदिश का उपयोग कर आकलन किया है कि β-galactosidase व्यक्त करता है । 5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) आम मन्या खंडों के धुंधला 3 दिनों के वेक्टर अर्क के बाद निकाल दिया, साथ ही β-galactosidase mRNA (दूत आरएनए) मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ श्रृंखला के साथ माप प्रतिक्रिया (qRT-पीसीआर), दक्षता, reproducibility, और transduced कोशिकाओं के स्थान का खुलासा करेंगे । प्रयोगों है कि transgene अभिव्यक्ति के प्रभाव की जांच करने के लिए या सीआईएस-अभिनय transcriptional तत्वों की गतिविधि को मापने के लिए, हम आम तौर पर transgene mRNA के स्तर और जीन स्थानांतरण के reproducibility के एक प्रारंभिक संकेत के रूप में उपाय ।

हमारी प्रयोगशाला में एक नया ऑपरेटर एक adenoviral सदिश के साथ transducing खरगोश आम मन्या धमनियों द्वारा इस विधि के साथ प्रवीणता स्थापित करने की मांग की (2 x 1011 वीपी/एक β-galactosidase transgene, एक cytomegalovirus (सीएमवी) द्वारा संचालित व्यक्त प्रमोटर. Transduced धमनियों 3 दिन बाद काटा गया था और खंडों में transversely काट रहे थे । व्यक्तिगत क्षेत्रों तो या तो खुला अक्षीय या बरकरार छल्ले के रूप में छोड़ दिया गया । खंडों के सभी microcentrifuge ट्यूबों में एक्स-लड़की दाग रहे थे । क्षेत्रों है कि खुले में कटौती की गई थी अक्षीय एक क्षैतिज सतह पर रखा गया था और चमकदार सतह अधिक से अधिक उजागर, पिन का उपयोग कर के रूप में कर्लिंग से खंड को रोकने के लिए की जरूरत है । एन चमकदार सतहों के चेहरे छवियों एक्स के साथ मजबूत endothelial धुंधला दिखाया-लड़की (3 ए और बी) । बरकरार मन्या रिंगों की चमकदार सतहों के अक्षीय छवियों केवल चमकदार सतह पर एक्स-gal धुंधला दिखाई देता है (3 सी और 3 डी) । जिन क्षेत्रों के सलए खोला गया था, वे या तो hematoxylin और eosin या नाभिकीय तेज लाल के साथ तेल, खोदी गई और प्रतिवाद में संसाधित किए गए थे । छवियां एक्स-endothelium में मुख्य रूप से धुंधला लड़की शो, हालांकि वहां adventitial परत में धुंधला की एक छोटी राशि है (आंकड़े 3E और 3F) । adventitial कोशिकाओं के Transduction arteriotomy साइट के माध्यम से या साइड शाखा बंधाव की साइटों को छोटी शाखाओं समीपस्थ के माध्यम से रिसाव द्वारा सदिश के रिसाव के माध्यम से हो सकता है । 29

एक अलग प्रयोग में, एक नए ऑपरेटर के लिए transgene अभिव्यक्ति के reproducible स्तर को प्राप्त करने में प्रवीणता की स्थापना की मांग की, transgenes की जैविक गतिविधियों की जांच के उद्देश्य से प्रयोगों के लिए एक प्रस्तावना के रूप में । खरगोश आम मन्या धमनियों सहायक-आश्रित एडीनोवायरस (2 x 1011 वीपी/एमएल) या तो एक एपीओ ए-I (HDAdApoAI) या IL-10 (HDAdIL10) transgene, दोनों एक सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण में युक्त के साथ transduced थे । Transduced धमनियों को transduction के बाद 3 दिन काटा गया और transversely को खंडों में काट दिया गया । आरएनए पोत प्रखंडों से निकाला गया था, और एपीओ ए-I और IL-10 mRNA भाव qRT-पीसीआर द्वारा quantified थे, सामान्यता के साथ glyceraldehyde 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH) mRNA एक ही अर्क (चित्रा 4) में). HDAdIL10-transduced धमनियों में, केवल 6 धमनियों में से 1 बहुत कम था, लेकिन जासूसी एपीओ a-I mRNA संकेत । एपीओ ए-मैं mRNA की अभिव्यक्ति का मतलब ७०० जहाजों में HDAdIL10 के साथ transduced से HDAdApoAI के साथ transduced में अधिक से अधिक गुना था । HDAdApoAI-transduced धमनियों में अंतर्जात आईएल-10 mRNA का निम्न स्तर पाया गया, मतलब अभिव्यक्ति के साथ HDAdIL10-transduced धमनियों में 6 गुना वृद्धि हुई । नोट की, transduction दक्षता और transgene अभिव्यक्ति में काफी अंतर-और अंतर-धमनी परिवर्तनशीलता है, जैसा कि क्रमशः 3 और 4में दिखाया गया है । हम अनुभवी ऑपरेटरों के साथ भी इस परिवर्तनशीलता पाते हैं ।

Figure 1
चित्र 1 . आम मन्या धमनी में Arteriotomy. ठीक संदंश मन्या धमनी adventitia समझ और धमनी के लिए ऊपर की ओर कर्षण लागू करने के लिए उपयोग किया जाता है । इस पैंतरेबाज़ी पोत लुमेन का विस्तार और एक ऊर्ध्वाधर सतह जिसमें तुला 19G सुई डाला जाता है उत्पंन करता है, जिससे धमनी के पीछे की दीवार puncturing के जोखिम को कम करने । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . आम मन्या arteriotomy के बंद. arteriotomy एक 7-0 के साथ बंद कर दिया है, एक एक्स पैटर्न का उपयोग कर सीवन । सुई और टांका के पहले दर्रा arteriotomy (साइट 1) के नीचे सही में धमनी लुमेन में प्रवेश करती है और नीचे (साइट 2) छोड़ दिया लुमेन से बाहर निकालता है । सुई और टांका तो arteriotomy पार और फिर से ऊपर सही (साइट 3) में लुमेन दर्ज करें । सुई तो ऊपर छोड़ दिया (4 साइट) में लुमेन बाहर निकलता है । सीवन के दोनों सिरों पर कोमल कर्षण arteriotomy बंद कर देता है । टांका समाप्त होता है (1 साइट और 4 साइट से बाहर निकलने) 2 वर्ग समुद्री मील के साथ बंधे हैं । ग्रे हलकों पोत दीवार के माध्यम से गुजर टांके की साइटों का प्रतिनिधित्व करते हैं । ठोस नीली लाइनें संकेत क्षेत्रों जहां सीवन पोत दीवार के बाहर है । डॉटेड नीली रेखाएं उन क्षेत्रों को इंगित करती है जहां सीवन लुमेन के भीतर है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . दक्ष endothelial transgene अभिव्यक्ति. खरगोश आम मन्या धमनियों एक adenoviral एक β-galactosidase transgene व्यक्त वेक्टर के साथ transduced थे और 3 दिन बाद काटा । Transduced धमनी क्षेत्रों एक्स-लड़की या तो बरकरार छल्ले के रूप में या एक अक्षीय कटौती के साथ खोला जा रहा है के बाद दाग रहे थे । (A-B) मन्या के छल्ले है कि खुले में काट रहे थे की चमकदार सतहों के चेहरे की छवियों के सलए । (सी-डी) बरकरार मन्या के छल्ले के चमकदार अंतरिक्ष में अक्षीय विचार । (E-F) एक्स-लड़की सना हुआ, आयल-एम्बेडेड मन्या खंडों खोदी गई थी और या तो (E) hematoxylin और eosin या (F) नाभिकीय तेज लाल के साथ जवाबी दाग । स्केल बार = १०० µm । मैं = intima; एम मीडिया =; और एक = adventitia । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . transgene mRNA अभिव्यक्ति की ठहराव. खरगोश आम मन्या धमनियों सहायक-आश्रित एडीनोवायरस एक सीएमवी प्रवर्तक के नियंत्रण में या तो एपीओ ए-I (HDAdApoAI) या IL-10 (HDAdIL10) व्यक्त करने के साथ transduced थे । धमनियों को 3 दिन बाद काटा गया । mRNA एक्सप्रेशन ऑफ (ए) एपीओ ए-मैं और (बी) आईएल-10 को qRT-पीसीआर द्वारा quantified किया गया, उसी धमनी में GAPDH mRNA को सामान्यीकृत किया गया, और मनमानी इकाइयों (AU) के रूप में व्यक्त की गई । बार मतलब मूल्य इंगित करता है; P मान रैंक-योग परीक्षण से है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

लाभ नुकसान
कुतर गए मॉडलों की तुलना रहनुमाओं को करीब phylogenetically अधिक खरीद और घर के लिए महंगा
अधिक आनुवंशिक विविधता, सहजता नैदानिक अनुवाद और नस्ल और संभाल करने के लिए मुश्किल
बड़े जहाजों आसान शल्य हेरफेर की अनुमति है और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए और अधिक ऊतक प्रदान करता है अधिक व्यापक विनियामक अपेक्षाएं
मनुष्यों के लिए डिजाइन अंतर्वाहिकी उपकरणों के उपयोग की अनुमति देता है कम आनुवंशिक रूप से संशोधित पृष्ठभूमि
कम-खरगोश प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी के व्यापक चयन
बड़े पशु मॉडल की तुलना में अपेक्षाकृत खरीद और घर के लिए सस्ती संभवतः कम चिकित्सकीय कुछ संवहनी रोगों के लिए अन्य बड़े पशु मॉडल की तुलना में प्रासंगिक
नस्ल और संभाल के लिए आसान
रोगाणु की तुलना में लाइन Transgenesis Transgene बड़ी धमनी में ही व्यक्त; विशेष रूप से ब्याज की साइट पर transgene का प्रभाव निर्धारित किया जा सकता है endothelium के अलावा अन्य कोशिकाओं के लिए विधि के आवेदन मुश्किल है
contralateral मन्या एक युग्मित नियंत्रण के रूप में उपयोग कर सकते हैं; अनियंत्रित चर के रूप में प्रणालीगत मापदंडों (उदा, रक्तचाप, कोलेस्ट्रॉल स्तर) को समाप्त करता है ऑपरेटिंग कमरे और शल्य चिकित्सा विशेषज्ञता की आवश्यकता; कोर सुविधाएं उपलब्ध नहीं होने की संभावना
बड़े पोत endothelium में डीएनए विनियामक अनुक्रम गतिविधि के परीक्षण के लिए उच्च प्रवाह Transgene अधिकांश संवहनी बिस्तरों में व्यक्त नहीं किया जा सकता
संभावित तेज और कम खर्चीला
ट्रांसजेनिक प्रोटीन की संभावना नहीं करने के लिए प्रणालीगत जोखिम-बंद न्यूनतम-लक्ष्य प्रभाव
प्रणालीगत जीन थेरेपी के दृष्टिकोण की तुलना में
(उदा. परिधीय नस इंजेक्शन के माध्यम से जिगर Transduction)		 अधिक-स्थिर transgene अभिव्यक्ति से प्रणालीगत (जिगर) जीन थेरेपी वेक्टर डिलिवरी शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप की आवश्यकता है
Transgene धमनी की दीवार में व्यक्त, ट्रांसजेनिक प्रोटीन के उच्च स्तर के स्थानीय वितरण की अनुमति ऑपरेटिंग कमरे और शल्य चिकित्सा विशेषज्ञता की आवश्यकता
ट्रांसजेनिक प्रोटीन की संभावना नहीं करने के लिए प्रणालीगत जोखिम-बंद न्यूनतम-लक्ष्य प्रभाव उपचार धमनियों कि विशेष रूप से हस्तक्षेप के लिए लक्षित कर रहे हैं तक ही सीमित; प्रणालीगत कारकों का इलाज नहीं करता है (जैसे, लिपिड)
contralateral मन्या एक युग्मित नियंत्रण के रूप में उपयोग कर सकते हैं; अनियंत्रित चर के रूप में प्रणालीगत मापदंडों (जैसे, रक्तचाप, कोलेस्ट्रॉल स्तर) को समाप्त
अब तक कम सदिश खुराक की आवश्यकता

तालिका 1. खरगोश आम मन्या धमनी endothelial-चयनात्मक जीन हस्तांतरण मॉडल के फायदे और नुकसान.

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Discussion

सर्जिकल तकनीक योग्यता विशेष ध्यान के कुछ पहलुओं । सावधान विच्छेदन के जरिए आम मन्या धमनी के पूर्ण प्रदर्शन और जुड़ाव जीन हस्तांतरण और arteriotomy मरम्मत की सुविधा होगी. हालांकि, विच्छेदन के दौरान, मन्या धमनी का सीधा हेरफेर vasospasm को रोकने के लिए छोटा किया जाना चाहिए । इसके अलावा, किसी भी धमनी से सटे खून बह रहा है धुंध के साथ हल्के दबाव लागू करने से रोका जाना चाहिए और extravasated रक्त तुरंत सामान्य खारा के साथ क्षेत्र कुल्ला द्वारा साफ किया जाना चाहिए । यह भी vagus तंत्रिका, जो आम मन्या धमनी के समानांतर चलाता है हानिकारक से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । छंटनी की योजना बनाई arteriotomy के क्षेत्र में adventitia ऑपरेटर दोनों एक स्वच्छ और कार्यात्मक arteriotomy प्रदर्शन करने के लिए और arteriotomy की मरंमत में मदद मिलेगी । अंत में, शाखाओं से आम मन्या धमनी की पहचान की जानी चाहिए और सुरक्षित रूप से ligated के रिसाव को रोकने के लिए के साथ मन्या लुमेन.

वेक्टर इन्फ्यूश़न और arteriotomy की मरंमत के भी महत्वपूर्ण पहलू हैं । वेक्टर अर्क के दौरान, यह आम मन्या शारीरिक या थोड़ा अधिक से अधिक कैलिबर कुशल transduction प्राप्त करने के लिए करना चाहते हैं करने के लिए महत्वपूर्ण है. जब arteriotomy की मरंमत, टांका arteriotomy के किनारों के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में पोत दीवार घुसना चाहिए, और साफ रूप से प्रवेश और लुमेन से बाहर निकलने के बजाय अक्षीय रूप से पोत दीवार के माध्यम से पारित करना चाहिए । यदि केवल पोत दीवार की बाहरी परतों को एक साथ खींचा जाता है क्योंकि सीवन दीवार के माध्यम से रेडियल से गुजरने के बजाय पोत दीवार के माध्यम से अक्षीय रूप से गुजरता है और लुमेन में प्रवेश करता है, एक अंतर intima में रहेगा और घनास्त्रता के जोखिम में वृद्धि होगी । यदि सीवन पैठ भी व्यापक रूप से स्थान पर हैं, या यदि टांका बंधा हुआ है, तो ऊतक परतों arteriotomy साइट पर बनाया जाएगा । ये मोड़ सामान्य लामिना रक्त प्रवाह को बाधित करते हैं, घनास्त्रता जोखिम भी बढ़ाते हैं. लगातार प्रवाह विशेषताओं को बनाए रखने के रोगों के पशु मॉडल में प्रदर्शन प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है (जैसे, atherosclerosis) क्योंकि बदल प्रवाह रोग30प्रक्रिया में योगदान कर सकते हैं ।

नए ऑपरेटरों अक्सर फसल में thrombosed धमनियों मुठभेड़ । चमकदार घनास्त्रता एक विनाशकारी जटिलता है, एक प्रयोगात्मक नमूना के रूप में अनुपयोगी धमनी प्रतिपादन । घनास्त्रता को रोकने के लिए, हम नियमित रूप से जीन हस्तांतरण से पहले चतुर्थ हेपरिन प्रशासन । घनास्त्रता भी arteriotomy को सावधान बंद करने से रोका गया है, जैसा कि ऊपर वर्णित है । हेपरिन खुराक घनास्त्रता को रोकने के लिए बढ़ाया जा सकता है, या एस्पिरिन पश्चात दिया जा सकता है. हालांकि, हेपरिन की एक उच्च खुराक भी खून बह रहा जटिलताओं के लिए क्षमता में वृद्धि होगी, और एस्पिरिन प्रयोगात्मक अंत अंक के साथ हस्तक्षेप सकता है, खासकर अगर सूजन का अध्ययन किया जा रहा है. इसलिए, यह घनास्त्रता को रोकने के एक साधन के रूप में बेहतर शल्य चिकित्सा तकनीक पर ध्यान केंद्रित करने के लिए बेहतर है ।

यदि बहुत तेजी से हेरफेर, मन्या धमनियों ऐंठन से गुजरना हो सकता है, जो भी प्रवाह को कम करके घनास्त्रता के लिए योगदान कर सकते हैं. यदि vasospasm पडा है तो उसे सामयिक papaverine के आवेदन से राहत मिल सकती है । जब पोत फसल transduction के बाद अधिक से अधिक 2-3 दिनों के लिए योजना बनाई है, और घनास्त्रता एक चिंता का विषय है, transcutaneous अल्ट्रासाउंड के लिए आक्रामक पोत प्रत्यक्षता का आकलन किया जा सकता है । thrombosed धमनियों की खोज इच्छामृत्यु के लिए नेतृत्व के लिए आवास की लागत पर बचाने के लिए हो सकता है । अतिरिक्त पशुओं को भी तत्काल नामांकित किया जा सकता है, प्रयोगात्मक समूहों को भरने के लिए । इस विधि से संबद्ध पेरि-और पोस्ट-हस्तक्षेप मृत्यु दर < 1% होनी चाहिए (अर्थात, स्वस्थ खरगोशों पर की गई अंय शल्य चिकित्सा से संबद्ध मृत्यु दर से भिंन नहीं)31।

एक ऑपरेटर के बाद शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल के तकनीकी पहलुओं के साथ सहज हो जाता है, एक क्षमता endothelium को कुशल जीन हस्तांतरण करने के लिए सत्यापित करने की जरूरत है, प्रतिनिधि परिणामों पर ऊपर अनुभाग में वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर । यदि reproducible जीन अंतरण प्राप्त करने के साथ समस्याएं उत्पंन होती हैं, तो दो क्षेत्रों में से एक में अपराधी होने की संभावना है । पोत के बाद अलग है और रक्त लुमेन से धोया जाता है, यह DMEM धोने बफर को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि संचार वेक्टर समाधान transduction के दौरान पतला नहीं है । अंय महत्वपूर्ण पहलू को शारीरिक या थोड़ा अधिक से अधिक कैलिबर वेक्टर अर्क के दौरान पोत का इरादा है । क्योंकि, हमारे अनुभव में, एक मन्या धमनी है कि पूरी तरह से नहीं किया जाता है या नहीं रह जाता है 20 के दौरान विनिर्मित कर दिया अर्क मज़बूती से कम transgene अभिव्यक्ति है, यह संभावना है कि शारीरिक क्षमता को धमनी के तनाव में सुधार transduction दक्षता. हालांकि, हमने इस व्यवस्थित रूप से कभी अध्ययन नहीं किया है । यह संभव है कि शारीरिक स्तर के ऊपर अर्क दबाव बढ़ाने transduction क्षमता में वृद्धि, और भी संवहनी मीडिया में कोशिकाओं के transduction के उच्च स्तर की अनुमति सकता है । हालांकि, endothelial बाधा के विघटन की संभावना पोत नुकसान होगा और घनास्त्रता के जोखिम में वृद्धि । यदि पोत पूरे 20 मिनट वेक्टर-मशीन अवधि के लिए नहीं रह जाता है, यह संभावना है कि वेक्टर आम मन्या धमनी की शाखाओं से लीक कर रहा है । विच्छेदन के दौरान सावधान रहें की पहचान करने के लिए और सभी शाखाओं ligate के रिसाव को रोकने के लिए वेक्टर मन्या लुमेन से.

इस विधि में खरगोशों के उपयोग से संबंधित कई सीमाएं हैं । खरगोश घर और अन्य बड़े जानवरों (कुत्तों, सूअर, भेड़) की तुलना में फ़ीड करने के लिए कम खर्चीला हैं; हालांकि, खरीद, आवास, और खिला खरगोश की लागत चूहों और चूहों के लिए की तुलना में काफी अधिक हैं । खरगोश सर्जरी के लिए ऑपरेटिंग कमरे सुविधाओं और नियामक आवश्यकताओं को भी कुतर के लिए की तुलना में कहीं अधिक व्यापक हैं । इसके अलावा, काफी तकनीकी विशेषज्ञता को शल्य चिकित्सा जीन अंतरण प्रोटोकॉल प्रभावी ढंग से प्रदर्शन करने की जरूरत है । इस विशेषज्ञता ऑपरेटरों जो कोई औपचारिक शल्य चिकित्सा प्रशिक्षण लिया है द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । हमारे समूह (इस पांडुलिपि के प्राथमिक लेखक सहित) में कम से कम 2 व्यक्तियों शल्य तकनीक सीखा है और उंहें उत्पादक लागू होता है । फिर भी, सावधानीपूर्वक प्रशिक्षण और एक ऑपरेटर के जीन स्थानांतरण दक्षता और reproducibility के एक सावधान सत्यापन (के रूप में प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में वर्णित है) की जरूरत से पहले ऑपरेटर के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पंन शुरू कर सकते हैं ।

इस विधि के साथ endothelium करने के लिए लगभग अनंय रूप से transgene अभिव्यक्ति की परिशोधन29,३२,३३,३४,३५,३६,३७ है में उपयोगी है कि यह endothelial कोशिकाओं और सीआईएस की गतिविधि के माप में transgene प्रभाव की जांच की अनुमति देता है-अभिनय डीएनए विनियामक अनुक्रम endothelial कोशिकाओं में । adventitial या औसत दर्जे की कोशिकाओं की एक छोटी संख्या transduced हो सकता है; हालांकि, कुशलता से transduce nonendothelial कोशिकाओं के लिए इस विधि की अक्षमता (जैसे चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और मैक्रोफेज) संवहनी दीवार कोशिकाओं के अन्य प्रकार के अध्ययन करने के लिए विधि के आवेदन को रोकता है । हालांकि transduced endothelial कोशिकाओं से स्रावित प्रोटीन के व्यक्त अन्य संवहनी कोशिका प्रकार पर इन प्रोटीन के प्रभाव की जांच की अनुमति दे सकते हैं, इन अन्य संवहनी कोशिका प्रकार में गैर स्रावित प्रोटीन की भूमिकाओं (उदारिसेप्टर्स या प्रोटीन संकेत transduction में शामिल) इस विधि से जांच नहीं की जा सकती ।

धमनी की दीवार को लक्षित जीन थेरेपी के परीक्षण के लिए एक साधन के रूप में, विधि दो प्रमुख तरीकों से अन्य नैदानिक तरीकों से अलग है । सबसे पहले, विधि vivo में जीन थेरेपी के परीक्षण के बजाय अधिक सामांयतः इस्तेमाल किया कुतर मॉडल8,12,15,३८,३९के लिए एक खरगोश मॉडल का उपयोग करता है । खरगोशों के उपयोग की अनुमति देता है transgene अभिव्यक्ति का आकलन और transgene उत्पाद की जैविक भूमिका एक पशु मॉडल है, जो मानव आनुवंशिक विविधता के अधिक प्रतिनिधि है में से एक नस्ल कुतर रहे हैं । मॉडल या तो सामांय खरगोश धमनियों में या खरगोश धमनियों कि धमनी विकृति है कि रोगग्रस्त मानव धमनियों में पाया के समान है में जीन थेरेपी का आकलन किया जा सकता है । खरगोश धमनियों को भी आकार में करीब से मानव धमनियों को कुतर रहे है धमनियों और विश्लेषण के लिए कहीं अधिक ऊतक प्रदान से कुतर धमनियों से उपलब्ध है । दूसरा बड़ा अंतर यह है कि इस विधि संवहनी endothelium करने के लिए transgene वेक्टर उद्धार करने के लिए एक शल्य दृष्टिकोण का उपयोग करता है । दैहिक जीन थेरेपी अक्सर प्रणालीबद्ध दिया जाता है, सबसे अक्सर transgene प्रोटीन25,४०के प्लाज्मा स्तर को बदलने के लक्ष्य के साथ जिगर को लक्षित करके । संवहनी endothelium लक्ष्यीकरण द्वारा, विधि चिकित्सीय transgene उत्पाद की आपूर्ति स्थानीय रूप से, धमनी की दीवार के भीतर अपने चरम एकाग्रता के साथ, ठीक है जहां यह संवहनी रोग के उपचार के लिए आवश्यक है । transgene केवल स्थानीय रूप से वितरित करके, विधि भी transgene उत्पाद के प्रणालीगत दुष्प्रभाव समाप्त । अंय समूहों को लक्ष्यीकरण के लिए पेप्टाइड्स, एंटीबॉडी, या अंय कैप्सिड संशोधनों का उपयोग कर तरीकों को विकसित कर रहे है प्रणालीबद्ध इंजेक्शन वैक्टर स्वस्थ या रोगग्रस्त endothelium को स्थानीय संवहनी जीन थेरेपी प्रदान करने के लिए४१,४२ , ४३. हालांकि, इन लक्ष्यीकरण विधियों के विकास के अंतर्गत रहते हैं, और अभी भी पर्याप्त प्रणालीगत transduction द्वारा जटिल हैं, विशेष रूप से जिगर में४२,४३,४४। हमारी शल्य चिकित्सा विधि transgenes का एक सटीक और कुशल शुरूआत के साथ संवहनी endothelium करने के लिए प्रदान करता है-अगर किसी भी अन्य स्थानों पर transduction. 1 विधि भी एक और अधिक सुविधाजनक, कुशल है, और उच्च मतलब भर में (रोगाणु लाइन transgenesis या endothelial के प्रणालीगत इंजेक्शन-लक्षित वैक्टर की तुलना में) बड़े पोत में डीएनए विनियामक दृश्यों की गतिविधि के परीक्षण के लिए endothelium, धमनी की दीवार में transgene प्रोटीन समारोह के परीक्षण के लिए, और परीक्षण पोत-दीवार के लिए जीन थेरेपी लक्षित ।

यह विधि किसी भी transgene की जैविक भूमिका की जांच की अनुमति देती है, जब यह बड़ी धमनी endothelium में व्यक्त की जाती है । यदि इस तरह के प्रमुख नकारात्मक रिसेप्टर्स या लघु hairpin आरएनए के रूप में हानि-समारोह के रिएजेंट के लिए संशोधित, यह अंतर्जात endothelial प्रोटीन और संकेत रास्ते की भूमिकाओं की जांच की अनुमति होगी । विधि भी बड़ी धमनी endothelial कोशिकाओं5,6,7में किसी भी सीआईएस अभिनय डीएनए अनुक्रम के transcriptional गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, विधि जीन हस्तांतरण के किसी भी प्रकार के परीक्षण की अनुमति देता है वेक्टर दक्षता और सुरक्षा के लिए जब endothelium के लिए स्थानीय स्तर पर दिया, और सदिश की क्षमता को उजागर करने के लिए टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति प्राप्त होगा । अंत में, विधि विकास और वैक्टर और transgenes है कि संवहनी दीवार वितरित करने के लिए डिज़ाइन कर रहे है के संयोजन के परीक्षण की अनुमति देता है जीन थेरेपी लक्षित । विधि एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में काम कर सकता है चिकित्सीय जीन की पहचान है कि हो सकता है-भविष्य में-सभी बड़ी धमनियों के endothelium को दिया (या सभी रोगग्रस्त बड़ी धमनियों) percutaneously इंजेक्टेड संवहनी दीवार द्वारा वैक्टर लक्षित । एडीनोवायरस प्रकार के लिए मानव में पूर्व मौजूदा उन्मुक्ति के कारण 5४५, यह नैदानिक अनुप्रयोगों में वैक्टर आधारित एडीनोवायरस प्रकार 5 का उपयोग करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो जाएगा. एडीनोवायरस के इंजीनियरिंग 5 कैप्सिड, वैकल्पिक एडीनोवायरस serotypes४६का उपयोग करें, या immunogenic के रूप में कम AAV वैक्टर का उपयोग क्लिनिक के लिए संवहनी जीन थेरेपी लाने के लिए आवश्यक हो सकता है । एक प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में, तथापि, हम किसी भी सदिश कि सहायक के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकते है अनजान है निर्भर एडीनोवायरस 5 रक्त वाहिकाओं में कुशल और टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति को प्राप्त करने में1।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम HDAd रिएजेंट, प्रशासनिक सहायता के लिए जूलिया Feyk, और शल्य चिकित्सा सलाह और समर्थन के लिए तुलनात्मक चिकित्सा पशु चिकित्सा सेवाओं के विभाग का उपयोग करने की अनुमति के लिए AdVec, Inc धंयवाद । यह काम HL114541 और जॉन एल लोके, जूनियर चैरिटेबल ट्रस्ट द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposables
3mL syringe with 24G needle Becton Dickinson 309571 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery
1mL syringe with 27G needle Becton Dickinson 309623 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery
20mL syringe, luer lock Nipro Medical Corp JD+20L
Catheters, 24G x 3/4" Terumo Medical Products SROX2419V
19G needle Becton Dickinson 305187 Gene transfer surgery only
21G needle Becton Dickinson 305165 For 20 mL syringe of saline
Gauze 4" x 4" Dynarex 3242 ~10-15 per surgery
3-0 silk suture Covidien Ltd. S-244
5-0 silk suture Covidien Ltd. S-182 Gene transfer surgery only
7-0 polypropylene suture CP Medical 8648P Gene transfer surgery only
5-0 polyglycolic acid suture CP Medical 421A Gene transfer surgery only
3-0 polyglycolic acid suture CP Medical 398A Gene transfer surgery only
Alcohol swabs Covidien Ltd. 6818 For placement of I.V. line
Catheter plug Vetoquinol 411498 Gene transfer surgery only
Ketamine HCl, 100 mg/mL Vedco Inc. 05098916106
Xylazine, 100 mg/mL Akorn Inc. 4821
Lidocaine HCl, 2% Pfizer 00409427702
Bupivacaine HCl, 0.5% Pfizer 00409161050
Beuthanasia D-Special Intervet Inc. NDC 00061047305 Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL  Patterson Veterinary 12496075705 Gene transfer surgery only
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride Baxter 2B1309 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one
Heparin  (5000 U/mL) APP Pharmaceuticals NDC 63323-047-10 Gene transfer surgery only
Fentanyl patch, 25 mcg/hr  Apotex Corp. NDC 60505-7006-2 Gene transfer surgery only
Isoflurane Multiple vendors Catalog number not available
Gene transfer vector Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straight Roboz RS-7900 Gene transfer surgery only
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt Roboz RS-6828
Needle holder /w suture scissors Miltex 8-14-IMC Gene transfer surgery only
Castroviejo scissors Roboz RS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock Roboz RS-6412 Gene transfer surgery only
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt Roboz RS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs Roboz RS-6514 2x
Backhaus towel clamp 3.5" Roboz 4x
Micro clip setting forceps 4.75" Roboz RS-6496 Gene transfer surgery only
Micro vascular clips, 11 mm Roboz 2x for gene transfer surgery only
Surg-I-Loop Scanlan International 1001-81M 5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width Roboz RS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm Roboz RS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip Roboz RS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3mm tips Roboz RS-7110 2x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tips Roboz RS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips Roboz RS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips Roboz RS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width Roboz RS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width Fine Science Tools 11092-12 2x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight Fine Science Tools 11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode MACAN Manufacturing HPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pump Multiple vendors Catalog number not available
Forced air warming unit 3M Bair Hugger Model 505 Gene transfer surgery only
IV infusion pump Heska Vet IV 2.2 Gene transfer surgery only
Isoflurane vaporizer and scavenger Multiple vendors Catalog number not available
Veterinary multi-parameter monitor Surgivet Surgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unit MACAN Manufacturing MV-9
Surgical microscope D.F. Vasconcellos M900 Needs ~16x magnification

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चिकित्सा अंक १३५ मानव रोग के पशु मॉडल atherosclerosis endothelium जीन थेरेपी शोधों की पढ़ाई खरगोश मन्या धमनी संवहनी रोग एडीनोवायरस
<em>Vivo में</em> खरगोश को जीन हस्तांतरण आम मन्या धमनी Endothelium
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Wacker, B. K., Bi, L., Dichek, D. A. In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium. J. Vis. Exp. (135), e56982, doi:10.3791/56982 (2018).

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