这项工作描述了一个协议, 以产生高分辨率的原位高中图书馆从严格分期预肠果蝇胚胎。
研究三维染色质体系结构对基因调控机制提供了宝贵的洞察力。在这里, 我们描述了一个协议, 执行的染色质构象捕获技术原位高 C 的分期果蝇胚胎种群。结果是一个测序库, 它允许在单个实验中对细胞核中发生的所有染色质相互作用进行映射。胚胎分类是用荧光立体显微镜和含有核标记的转基因飞线人工完成的。使用这种技术, 每个核分裂周期的胚群, 并具有明确的细胞周期状态, 可以获得非常高纯度。该议定书还可用于对肠以外的老龄胚胎进行排序。已分类的胚胎被用作原位高 C 的输入。所有的实验, 包括测序库准备, 都可以在五天内完成。该协议具有较低的输入要求, 并以20期胚盘级胚胎作为输入材料可靠地工作。最终结果是对下一代排序的排序库。在测序后, 这些数据可以被处理成全基因组的染色质相互作用图, 可以使用多种可用的工具进行分析, 以获取有关拓扑关联域 (泰德) 结构、染色质循环和染色质的信息。在果蝇发育期间的车厢。
染色质构象捕获 (3C) 已成为一个非常有用的方法来研究染色质在细胞核1的拓扑。3C 变体高 C 允许测量在单个实验2中原子核中发生的所有染色质相互作用的接触频率。在发现和表征染色质组织的许多基本原则, 如 TADs、隔间、环路3、4、5等方面, 应用高 C 技术发挥了重要作用。
在发育过渡和细胞分化的背景下, 染色质结构的研究越来越被用来解开基因调控的机制, 在这些过程中,6,7,8, 9。果蝇是一种非常感兴趣的模型生物体, 其发育和基因组具有良好的特征。然而, 很少有研究发现,在离体组织培养环境外,果蝇的染色质结构已经进行了10,11。在胚胎 16–18 h 后受精, TADs 和隔间, 让人联想到哺乳动物的相似结构10, 这引发了他们在果蝇胚胎基因调控中扮演的角色的问题发展。特别是在肠之前的早期发展阶段, 这种研究在技术上具有挑战性。在肠之前,果蝇胚胎经历13个同步核分裂, 以极快的速度8–60每周期12,13。除此之外, 由于缺乏视觉特征来区分不同的阶段, 使得很难获得足够数量的紧密的胚胎材料。
为了制定一个协议, 允许研究早期果蝇发展的染色质结构在核周期分辨率, 我们结合了两种现有的技术:原位高 C, 这使得生成的高度分辨率整体基因组联系图5, 和胚胎分期使用转基因果蝇线表达 eGFP-PCNA 转基因13,14。这种转基因本地化在细胞间的细胞核, 在有丝分裂过程中分散在合胞期胚盘。利用这一特性, 通过 GFP 信号的分散, 可以很容易地区分不同阶段的核密度和有丝分裂胚胎。
结合起来, 这些技术使研究三维染色质结构的高分辨率从多达 20果蝇胚胎。这项议定书包括关于从单一核分裂周期获取和分类果蝇胚胎以获得胚胎种群的指示。进一步描述了所获得的胚胎如何被用来进行原位的高 C。最终结果是一个核苷酸库, 适合于排序的下一代测序机。随后的测序读数可以处理成详细的染色质相互作用图, 覆盖整个果蝇基因组。
这里提出的协议是非常有效的生成高质量的图谱结构的早期果蝇胚胎。与较早的协议34相比, 此处描述的方法使用最新的原位高 C 程序5, 从而更快地处理、更高的分辨率和较少的试剂使用。整个过程, 包括原位的高 C 协议, 预计将工作在广泛的阶段和实验系统, 除了果蝇。由于该协议的输入要求很低, 因此也可以用于孤立的细胞群。果蝇在这里所描述的范围以外的胚胎使用协议时, 某些参数, 特别是材料的固定, 可能需要调整。由于年长的胚胎发育一个高度不透水的角质层, 提高甲醛浓度和延长固定可能是适当的。为在核循环14以外的阶段采集胚胎, 步骤1.4 中25°c 的胚胎潜伏期需要调整如下: 核循环 12, 70 分钟;核循环 13, 90 分钟;3–4 hpf, 三点半 h。
在13的分裂分裂 (阶段 1-4), 原子核密度大致加倍与每个分裂。它们的明亮的 GFP 荧光可以很容易地识别细胞核。在有丝分裂过程中, eGFP-PCNA 不位于细胞核内, 其信号分散在整个胚胎中。此功能使识别正在进行同步分裂分裂的胚胎成为可能。为了研究染色质构象, 这些有丝分裂的胚胎通常是不可取的, 因为染色质的有丝分裂组织明显不同于界面组织35。这是可能的调整协议, 具体选择胚胎正在进行同步有丝分裂分裂。在这种情况下, 只有有分散的, 非核分布的 eGFP-PCNA 的胚胎应保持, 所有其他胚胎应丢弃。由于无法确定核密度, 因此必须使用在透射光显微术中观察到的以其形态学来分期胚胎的替代方法。胚胎周围的极细胞和细胞核的存在表明胚胎已经完成了至少9核循环, 而外围可见的 cellularization 表明核循环 1412。
高 C 实验可以使用多种限制酶5成功地进行。目前的方法通常使用识别4基序列 (如 MboI) 或6基识别站点 (如 HindIII) 的酶。4基刀具超过6基刀具的优点是, 它们提供了更高的潜在分辨率, 给定足够的测序深度, 并且更均匀地覆盖整个基因组的限制点。在5、23、36、37选择一个4基刀具时, 没有明显的优势。两种最常用的酶, MboI 和 DpnII, 都承认相同的 GATC 识别站点。DpnII 对中央甲基化不太敏感, 对果蝇没有任何关系。在这里提出的协议也可以成功地完成使用 DpnII 作为限制酶。在第4.2 节中。根据制造商的建议, 限制酶和缓冲器必须调整 DpnII 兼容性。
如果序列库的片段大小与图 2A所示的范围显著偏离, 则在排序过程中的簇形成可能效率较低或完全失败。在这种情况下, 应检查剪切后的尺寸分布, 并相应地调整剪切参数。非常小 ( 1000 bp) 大小的 DNA 片段分布的峰值表明了尺寸选择的问题, 例如, 应丢弃的珠子或上清液。通常, 这些小峰在这些不合适的大小的库, 如图所示, 仍然是成功的排序, 只有轻微降低集群效率。
应避免高速率的 PCR 复制, 因为这大大减少了可用序列读取的数量。PCR 重复率与输入材料量直接相关。因此, 使用更多的输入通常会缓解 PCR 重复的问题。
由于读取方向而过滤的读数越多(图 2B)表示消化不足, 这可能是由于使用太少的酶、过多的输入材料或胚胎的不完全同质化造成的。
The authors have nothing to disclose.
这项研究由普朗克社会资助。C.B.H. 得到了来自国际普朗克研究学院–分子生物医学的奖学金。我们感谢谢尔比布莱斯和埃里克 Wieschaus 好心提供 eGFP-PCNA果蝇线。
Biotin-14-dATP | Life Technologies | 19524016 | |
MboI | New England Biolabs | R0147L | |
DNA Polymerase I Klenow Fragment | New England Biolabs | M0210L | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher | EL0012 | T4 DNA Ligase Buffer included |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
Proteinase K | AppliChem | A4392 | |
GlycoBlue | Life Technologies | AM9516 | |
Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors | Roche | 5892791001 | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) | New England Biolabs | E7335 | Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit |
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England Biolabs | E7645 | End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit |
Covaris S2 AFA System | Covaris | ||
DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030108051 | |
Falcon cell strainer 100 µm | Corning | 352360 | Embryo collection baskets |
37% formaldehyde | VWR | 437536C | |
Heptane | AppliChem | 122062.1612 | |
M165 FC fluorescent stereo microscope | Leica | ||
M165 FC DFC camera | Leica | ||
Metal micro pestle | Carl Roth | P985.1 | Used to lyse embryos in step 4.1.4 |
RNase A | AppliChem | A3832,0050 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies | 65002 | Streptavidin coated magnetic beads |
Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
eGFP-PCNA flies | Gift from S. Blythe and E. Wieschaus | ||
Sodium hypochlorite 13% | Thermo Fisher | AC219255000 | |
Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology | AppliChem | A4577 | |
NaCl | AppliChem | A2942 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
SDS for molecular biology | AppliChem | A2263 | |
10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
PCR Nucleotide Mix | Sigma-Aldrich | 11814362001 | Unmodified dCTP, dGTP, dTTP |
BSA, Molecular Biology Grade | New England Biolabs | B9000S | |
EDTA 0.5M solution for molecular biology | AppliChem | A4892 | |
Sodium acetate 3M pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | |
DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | Magnetic stand |
Intelli-Mixer RM-2L | Omnilab | 5729802 | Rotator |
ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | Mixer |
Small Embryo Collection Cages | Flystuff.com | 59-100 | Egg collection cage |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000413 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
PCR tube strips | Greiner Bio-One | 673275 | |
NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | T4 DNA Polymerase buffer |