Мышь жировой ткани сбора и обработки для анализа РНК
Summary
Цель данного документа – представить пошаговые процедуры для сбора различных белой жировой ткани от мышей, обработки жира образцов и извлечь РНК.
Abstract
По сравнению с другими тканями, белой жировой ткани имеет значительно меньше РНК и белков содержание для вниз по течению приложений, таких как реальном масштабе времени PCR и западной помарки, поскольку он главным образом содержит липиды. РНК изоляции от образцах адипозных тканей также сложной, как избежать эти липиды требуются дополнительные шаги. Здесь мы представляем процедура собрать три анатомически разные белой жировой ткани от мышей, чтобы обрабатывать эти образцы и выполнять РНК изоляции. Далее мы опишем синтез cDNA и ген выражение экспериментов с использованием ПЦР в реальном времени. Настоящим описывается протокол позволяет сокращение загрязнения от волос и кровь на жировых отложений, а также загрязнения между различными жировых отложений во время сбора ткани животного. Он также был оптимизирован обеспечить достаточное количество и качество РНК извлечены. Этот протокол может широко применяться к любой модели мыши, где жировой ткани образцы требуются для обычных экспериментов например ПЦР в реальном времени, но не предназначен для изоляции от первичных адипоцитов клеточной культуры.
Introduction
Ожирение является всемирной эпидемии, которая может привести к осложнениям, например, тип 2 диабет1. Диета индуцированной ожирением и генетически модифицированных животных модели часто используются для исследования в ожирения и его осложнений связанные. Традиционно белой жировой ткани известен как отсек для избыток энергии и в основном состоит из липидов, в то время как коричневая жировая ткань преобразует энергию в тепло2,3. Жировой ткани является динамичным и будет расширять и сокращаться в зависимости от многих факторов, таких, как прием пищи и физической активности. Таким образом чтобы определить факторы, способствующие эти изменения, адекватные жировой ткани сбор и обработка являются требуется4.
Среди белой жировой ткани общепризнано, что подкожно и висцерального жира склады имеют различные свойства, такие как анатомической локализации и функционируют2,5. Следовательно чтобы избежать противоречивых результатов или большой изменчивостью, внимание необходимо предпринять во избежание перекрестного загрязнения между этими различными жировых отложений при сборе жировых отложений.
Кроме того есть три основных проблемы, при изоляции RNA или протеина от мышей белой жировой ткани. Во-первых собирая жировых отложений в ожирением мышей является не является легкой задачей, как граница, которая отделяет различные белый жировых депо не всегда ясно, в отличие от других органов, как почки и сердце6. Во-вторых из-за высоких липидов содержание жировой ткани, при изоляции RNA или протеина, слой липидов плавает на вершине и предотвращает прямой доступ к образцу. В-третьих, белой жировой ткани в отличие от коричневая жировая ткань или другие ткани, имеет значительно меньше РНК и белков содержание и это серьезной проблемой при использовании молодых мышей, мышей кормили нормальной диете (N) и мышей, которые должны иметь низкий жировой массы (т.е. KO модели, лечение препаратами, осуществлять подготовку, и т.д.) 7 , 8.
Таким образом важно выбрать подходящий метод, чтобы изолировать РНК из жировой ткани. Альтернативные методы для извлечения фенольных/хлороформ являются коммерческие наборы. Они обычно основаны на первоначальный фенола извлечения шаг, затем РНК на столбец9. Эти наборы являются более дорогостоящими, как правило дают образцы ниже доходности, в то время как качество РНК может быть переменная однако и менее затратным по времени. Однако один из самых больших преимуществ для фенола раствор/хлороформ извлечения описанных здесь является возможность изолировать РНК, ДНК и белка от одного образца10. Поскольку мышь жировых отложений обычно малы и дать небольшое количество белков и РНК (особенно в худой мыши модели), эти протоколы максимально данных, которую можно получить из небольшой пример.
Цель настоящего документа заключается в подробно описать метод для обеспечения адекватного проб из трех мышей белой жировой ткани складов, а также количество и качество изоляции РНК. РНК, получены этот протокол может использоваться для выполнения в реальном времени анализы ПЦР. Этот протокол не предназначен для изоляции RNA от искусственного первичной адипоцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Следующие ВЧ диета питание, ожирением мышей были обнаружены увеличились тела и белой жировой ткани веса по сравнению с мышей кормили N диета. РНК, извлечены с помощью раствора фенола принесли образцы с хорошим чистоты. Лептин является АдипоКин главным образом производимые жировой тк?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана диабета Канады.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
Referências
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
