Accumulazione del tessuto adiposo del mouse ed elaborazione per l'analisi del RNA
Summary
Lo scopo di questa carta è di presentare una procedura dettagliata per raccogliere diversi tessuti adiposi bianchi dai topi, trattare i campioni di grasso ed estrarre RNA.
Abstract
Rispetto ad altri tessuti, tessuto adiposo bianco ha un considerevolmente meno contenuto di RNA e proteine per applicazioni a valle come Real-Time PCR e Western Blot, poiché esso contiene principalmente i lipidi. Isolamento del RNA dai campioni di tessuto adiposo è impegnativo anche come passaggi aggiuntivi sono necessari per evitare questi lipidi. Qui, presentiamo una procedura per raccogliere tre tessuti adiposi bianchi anatomicamente diversi da topi, per elaborare questi campioni ed eseguire isolamento del RNA. Descriviamo ulteriormente la sintesi di cDNA e gene esperimenti di espressione mediante Real Time PCR. Il protocollo descritto dichiara permette la riduzione della contaminazione dell’animale capelli e sangue su cuscinetti adiposi, nonché la contaminazione incrociata tra diversi rilievi grassi durante la raccolta del tessuto. Esso è stato ottimizzato anche per garantire un’adeguata quantità e qualità del RNA estratto. Questo protocollo può essere ampiamente applicato a qualsiasi modello di topo dove campioni di tessuto adiposo sono necessari per gli esperimenti di routine come la PCR in tempo reale, ma non è inteso per l’isolamento da colture cellulari primarie adipocytes.
Introduction
L’obesità è un’epidemia mondiale che può portare a complicazioni quali 2 diabete di tipo1. Modelli animali obesi e geneticamente indotta da dieta sono frequentemente utilizzati per la ricerca in obesità e delle complicanze associate. Tradizionalmente, il tessuto adiposo bianco è conosciuto come un vano portaoggetti per l’energia in eccesso ed è prevalentemente composto da lipidi mentre il tessuto adiposo bruno converte l’energia in calore2,3. Tessuto adiposo è dinamico e sarà ampliata e ridursi a seconda di molti fattori come l’ingestione di cibo e attività fisica. Quindi, per determinare i fattori che contribuiscono a questi cambiamenti, tessuto adiposo adeguata raccolta e manipolazione sono necessari4.
Tra i tessuti adiposi bianchi, è generalmente accettato che i depositi di grasso sottocutanei e viscerali hanno proprietà diverse, ad esempio la localizzazione anatomica e funzionano2,5. Di conseguenza, per evitare risultati contraddittori o grande variabilità, attenzione deve essere presa per evitare la contaminazione incrociata tra questi diversi depositi di grasso quando si raccolgono i cuscinetti adiposi.
Inoltre, ci sono tre grandi sfide quando isolando RNA o proteine da tessuto adiposo di topi bianchi. In primo luogo, raccogliendo i cuscinetti adiposi in topi obesi non è un compito facile come il confine che separa i diversi depositi di grasso bianchi non è sempre chiaro, a differenza di altri organi come i reni e cuore6. In secondo luogo, a causa del contenuto elevato del lipido del tessuto adiposo, durante l’isolamento di RNA o proteine, uno strato di lipidi galleggia sulla parte superiore e impedisce l’accesso diretto al campione. In terzo luogo, in contrasto con il tessuto adiposo bruno o altri tessuti, tessuto adiposo bianco è considerevolmente minore contenuto di RNA e proteine e questo è di grande preoccupazione quando si utilizza giovani topi, topi alimentati una dieta normale (N) e topi che dovrebbero abbiano basse masse grasse (cioè KO modelli, trattamento con farmaci, esercitano di formazione, ecc.) 7 , 8.
Di conseguenza, scegliere il metodo appropriato per isolare il RNA dal tessuto adiposo è fondamentale. Metodi alternativi all’estrazione del fenolo/cloroformio sono kit commerciali. In genere si basano su una fase di estrazione del fenolo iniziale, seguita da purificazione RNA su una colonna9. Tuttavia, quei kit sono in genere più costosi e dare campioni di rendimento più basso, mentre la qualità di RNA potrebbe essere variabile ma sono molto meno tempo. Tuttavia, uno dei maggiori vantaggi di estrazione del fenolo soluzione/cloroformio descritto qui è la possibilità di isolamento del RNA, DNA e proteina da un singolo campione10. Dal momento che i rilievi grassi topi sono solitamente piccoli e dare piccole quantità di RNA e proteine (soprattutto in modelli murini magra), questi protocolli massimizzano i dati uno può uscire da un piccolo campione.
L’obiettivo di questa carta è di descrivere in dettaglio un metodo per garantire la raccolta di campioni adeguati da depositi di tessuto adiposo bianco tre topi come pure la quantità e la qualità di isolamento del RNA. RNA ottenuto seguendo questo protocollo consente di eseguire analisi di PCR in tempo reale. Questo protocollo non è destinato all’isolamento del RNA dai adipocytes primario coltivati.
Protocol
Representative Results
Discussion
HF-dieta seguente nutrire, topi obesi sono stati trovati una maggiore corpo e tessuto adiposo bianco pesi rispetto ai topi alimentati con una dieta di N. RNA estratto usando fenolo soluzione dato i campioni con buona purezza. Leptina è un’adipochina prodotta principalmente da tessuto adiposo ed è conosciuta per correlare positivamente con massa grassa16. Come previsto, espressione di mRNA di leptina aumentata di topi obesi in concomitanza con la loro massa grassa.
Que…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da diabete Canada.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
Referências
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
