Souris tissus adipeux collecte et le traitement pour l’analyse de l’ARN
Summary
Le but de cet article est de présenter une procédure étape par étape pour rassembler différents les tissus adipeux blancs de souris, de traiter les échantillons de matières grasses et d’extraire des RNA.
Abstract
Par rapport à d’autres tissus, le tissu adipeux blanc a une beaucoup moins teneur en ARN et des protéines pour des applications en aval comme la PCR en temps réel et Western Blot, puisqu’il contient surtout des lipides. Isolement d’ARN d’échantillons de tissus adipeux est aussi difficile que des mesures supplémentaires sont nécessaires pour éviter ces lipides. Nous présentons ici une procédure pour rassembler le tissu adipeux blanc trois anatomiquement différent de souris, pour traiter ces échantillons et effectuer des ARN. Nous décrivons plus loin la synthèse de cDNA et gène expériences d’expression à l’aide de la PCR en temps réel. Le protocole décrit par les présentes permet la réduction de la contamination de cheveux et de sang sur les coussinets adipeux ainsi que la contamination croisée entre les coussinets adipeux différents au cours de la collection de tissus de l’animal. Il a également été optimisé afin d’assurer une quantité adéquate et la qualité de l’ARN extrait. Ce protocole peut être largement appliqué à n’importe quel modèle de souris où des échantillons de tissus adipeux sont requises pour des expériences courantes comme la PCR en temps réel mais n’est pas prévu pour l’isolement de la culture de cellules primaires adipocytes.
Introduction
L’obésité est une épidémie mondiale qui peut conduire à des complications comme le type 2 diabète1. Induite par l’alimentation obèses et génétiquement modifiés des modèles animaux sont fréquemment utilisés pour la recherche dans l’obésité et ses complications associées. Traditionnellement, le tissu adipeux blanc est connu comme un compartiment de rangement pour excès d’énergie et est surtout composé de lipides alors que le tissu adipeux brun convertit l’énergie en chaleur2,3. Le tissu adipeux est dynamique et agrandira et rétrécir en fonction de nombreux facteurs tels que la prise alimentaire et l’activité physique. Par conséquent, pour déterminer les facteurs ayant contribué à ces changements, manutention et collecte adéquate du tissu adipeux sont requis4.
Parmi les tissus adipeux blancs, il est généralement admis que les dépôts de graisse sous-cutanée et viscérales ont des propriétés différentes comme la localisation anatomique et fonctionnent2,5. Par conséquent, pour éviter des résultats contradictoires ou grande variabilité, attention doit être prises pour éviter la contamination croisée entre ces différents dépôts de graisse lors de la collecte des coussinets adipeux.
En outre, il y a trois défis majeurs lorsque isoler l’ARN ou les protéines du tissu adipeux blanc souris. Tout d’abord, le collecte des coussinets adipeux chez des souris obèses n’est pas une tâche facile car la frontière qui sépare les différents dépôts de graisse blanches n’est pas toujours claire, contrairement à d’autres organes comme les reins et le coeur6. Deuxièmement, en raison de la teneur élevée en lipides du tissu adipeux, lors de l’ARN ou protéine isolation, une couche de lipides flotte sur le dessus et empêche l’accès direct à l’échantillon. Troisièmement, par opposition au tissu adipeux brun ou d’autres tissus, le tissu adipeux blanc a considérablement plus faible teneur en ARN et des protéines et il s’agit d’une préoccupation majeure lors de l’utilisation de jeunes souris, souris nourries d’une normale (N) et souris qui sont censés ont faibles masses grasses (par exemple KO modèles, traitement par des médicaments, exercent de formation, etc..) 7 , 8.
Choisir la méthode appropriée pour isoler l’ARN du tissu adipeux est donc essentiel. Méthodes alternatives à l’extraction de phénol/chloroforme sont les kits commerciaux. Ils reposent généralement sur une étape d’extraction de phénol initiale, suivie de purification RNA sur une colonne9. Cependant, ces kits sont en général plus coûteuses et donnent des échantillons de rendement plus faible, tandis que la qualité de RNA peut être variable mais sont beaucoup moins de temps. Cependant, un des grands avantages de l’extraction de solution/chloroforme phénol décrite ici est la possibilité d’isoler l’ARN, ADN et protéine d’un seul échantillon10. Étant donné que les coussinets adipeux de souris sont généralement petits et donnent la petite quantité d’ARN et de protéines (en particulier dans les modèles de souris maigre), ces protocoles maximisent les données on peut sortir d’un petit échantillon.
L’objectif de cet article est de décrire en détail une méthode afin d’assurer un prélèvement adéquat de dépôts de tissu adipeux blanc trois souris ainsi que de quantité et de qualité des ARN. RNA obtenu en suivant ce protocole peut être utilisé pour effectuer des analyses par PCR en temps réel. Ce protocole n’est pas prévu pour l’isolement des adipocytes primaires cultivées.
Protocol
Representative Results
Discussion
HF-régime suivant l’alimentation, les souris obèses se sont avérées ont augmenté le corps et le tissu adipeux blanc poids par rapport aux souris nourries d’un N. ARN extrait à l’aide de solution de phénol ont donné des échantillons avec bonne pureté. La leptine est une adipokine principalement produite par le tissu adipeux et est connue pour la corrélation positive avec la masse grasse16. Comme prévu, expression de l’ARNm leptine a augmenté chez les souris obèses en concomita…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par diabète Canada.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
Referências
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
