העכבר רקמת שומן איסוף ועיבוד לניתוח RNA
Summary
מטרת מאמר זה היא להציג הליך שלב אחר שלב כדי לאסוף רקמות adipose לבן שונים של עכברים, לעבד את דגימות השמן ולחלץ את ה-RNA.
Abstract
בהשוואה לרקמות אחרות, שומן לבן יש הרבה פחות RNA וחלבון תוכן עבור יישומים במורד הזרם כגון PCR בזמן אמת המערבי כתם, שכן הוא בעיקר מכיל שומנים. בידוד RNA מדגימות רקמת שומן הוא מאתגר גם צעדים נוספים נדרשים להימנע שומנים אלה. כאן, אנו מציגים את הליך איסוף שלוש רקמות adipose שונה מבחינה אנטומית לבן עכברים, לעבד את דגימות אלה ולבצע בידוד ה-RNA. בהמשך נתאר את הסינתזה של ניסויים ביטוי cDNA וג’ין באמצעות PCR בזמן אמת. הפרוטוקול המתואר בזאת מאפשר הפחתת זיהום מן הדם על רפידות השמן, כמו גם זיהום צולב בין פדים שמנים שונים במהלך איסוף רקמת והשיער של החיה. זה גם מוטבה כדי להבטיח ובאיכות של RNA חילוץ. פרוטוקול זה ניתן להחיל באופן נרחב על כל דגם העכבר בו דוגמאות רקמת שומן נדרשים לניסויים שגרתיות כגון PCR בזמן אמת, אך אינו מיועד לבידוד מתרבות תא adipocytes הראשי.
Introduction
השמנה היא מגפה עולמית אשר יכול להוביל לסיבוכים כגון סוג 2 סוכרת1. דיאטה-induced מהשמנת יתר, מהונדסים מודלים בעלי חיים משמשים לעתים קרובות למחקר, השמנת יתר, סיבוכים הקשורים. באופן מסורתי, שומן לבן המכונה בה תא אחסון אנרגיה עודפת, מורכב בעיקר שומנים בזמן רקמת שומן חום ממירה אנרגיה חום2,3. רקמת שומן הוא דינמי, להתרחב ולהתכווץ בהתאם לגורמים רבים כגון צריכת המזון ופעילות גופנית. לפיכך, כדי לקבוע את הגורמים התורמים לשינויים אלה, רקמת שומן מספקת אוסף וטיפול הם נדרשים4.
בין רקמות adipose לבן, זה מקובל כי המחסנים שומן תת עורית של הקרביים שיש לה מאפיינים שונים כגון לוקליזציה אנטומיים, לתפקד2,5. כתוצאה מכך, כדי למנוע תוצאות סותרות או השתנות גדולה, תשומת הלב צריך לקחת כדי למנוע זיהום צולב בין אלה המחסנים שומן שונה בעת איסוף שמן רפידות.
יתר על כן, ישנם שלושה אתגרים מרכזיים כאשר בידוד RNA או החלבון של רקמת שומן עכברים לבנים. ראשית, איסוף רפידות שומן בעכברים שמנים אינה משימה קלה כפי הגבול המפריד בין המחסנים שומן לבן שונה אינה חד משמעית, בניגוד לאיברים אחרים כגון הכליות, הלב6. שנית, בגלל התוכן שומנים גבוהה בדם של רקמת שומן, במהלך בידוד RNA או החלבון, שכבה של ליפידים צף למעלה, מונע גישה ישירה המדגם. שלישית, בניגוד רקמת שומן חום או רקמות אחרות, שומן לבן תוכן RNA וחלבונים נמוך משמעותית, זו הדאגה העיקרית בעת שימוש עכברים צעירים, עכברים האכיל דיאטה רגילה (N) ויש עכברים אשר צפויים ההמונים שומן נמוכה (קרי KO מודלים, טיפול עם תרופות, תרגיל אימונים, וכו ‘.) 7 , 8.
לכן, בחירת השיטה המתאימה כדי לבודד את הרנ א של רקמת שומן חיוני. שיטות אלטרנטיביות למניעת פנול/כלורופורם החילוץ הם ערכות מסחריות. הם מבוססים בדרך כלל על צעד החילוץ הראשוני פנול, ואחריו RNA טיהור על עמודה9. עם זאת, ערכות אלה בדרך כלל יקרים יותר, לתת דוגמאות תשואה נמוכה יותר, תוך איכות RNA יכול להיות משתנה אבל פחות זמן רב. עם זאת, אחד היתרונות הגדולים של פנול פתרון/כלורופורם החילוץ המתוארים כאן היא האפשרות של בידוד RNA DNA, חלבונים מן מדגם יחיד10. כיוון רפידות השמן עכברים קטנים בדרך כלל לתת כמות קטנה של RNA וחלבונים (במיוחד במודלים העכבר רזה), פרוטוקולים אלה למקסם את הנתונים אחד יכול לצאת מדגם קטן.
מטרת המאמר היא לתאר בפירוט שיטה כדי להבטיח מדגם נאותה מהאוסף מחסני רקמת שומן לבן שלושה עכברים וכן בכמות ובאיכות של RNA בידוד. RNA מושגת על ידי ביצוע פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מבחני ה-PCR בזמן אמת. פרוטוקול זה אינו מיועד לבידוד RNA מ adipocytes הראשית בתרבית.
Protocol
Representative Results
Discussion
הבאים HF-דיאטה האכלה, העכברים המשמינים נמצאו הגדילו הגוף ועובי שומן לבן לעומת עכברים שקיבלו תזונה N. RNA חילוץ באמצעות פנול פתרון הניב דגימות עם טוהר טוב. לפטין adipokine המיוצר בעיקר על ידי רקמת שומן, ידוע כדי להתאים באופן חיובי עם מסת שומן16. כצפוי, לפטין mRNA הביטוי עלה בעכברים שמנים ב …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי סוכרת קנדה.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
Referências
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
