凍結断面化のための磁気ナノ粒子転写ウイルスベクターを用いた一次マウス腸オルガノイドの遺伝子工学
Summary
我々は、1)レンチまたはレトロウイルス伝達のための磁気ナノ粒子を使用して腸内オルガノイドを効率的に設計し、2)工学的オルガノイドから凍結切片を生成するステップバイステップの指示を説明する。このアプローチは、下流の効果を調査するためにオルガノイドの遺伝子発現を効率的に変更するための強力なツールを提供します。
Abstract
腸内オルガノイド培養は、インビトロで腸幹細胞と暗号生物学を調べるユニークな機会を提供しますが、オルガノイドの遺伝子発現を操作する効率的なアプローチは、この分野で限られた進歩を遂げています。CRISPR/Cas9技術は、オルガノイド生成のための細胞の正確なゲノム編集を可能にしますが、この戦略は、時間とコストの両方である配列分析による広範な選択とスクリーニングを必要とします。ここでは、腸内オルガノイドの効率的なウイルス伝達のための詳細なプロトコルを提供する。このアプローチは迅速かつ高効率であるため、CRISPR/Cas9テクノロジーに固有の時間と費用を削減できます。また、遺伝子発現やサイレンシングを確認するために使用できる免疫組織化学的または免疫蛍光染色を用いたさらなる分析のために、無傷のオルガノイド培養物から凍結切片を生成するプロトコルを提示する。遺伝子発現またはサイレンシングのためのウイルスベクターの正常な伝達が達成された後、腸幹細胞および暗号機能を迅速に評価することができる。ほとんどのオルガノイド研究はインビトロアッセイを採用していますが、オルガノイドは生体内機能解析のためにマウスに送達することもできます。また、現在利用可能な治療法は、ゲノムを変えるのではなく遺伝子発現やタンパク質機能を調節することによって一般的に機能するため、薬剤に対する治療応答を予測する上で有利です。
Introduction
マウスまたはヒトの暗号を小腸または結腸から長期間にわたって3次元(3D)オルガノイドとして培養する能力は、これらの培養物が生体内の腸上皮の特徴を定義するので、大きなブレークスルーを提供した1,2,3.原発性暗号に由来するオルガノイドは、自己更新および自己組織化が可能であり、起源の組織と同様の細胞機能を示す。実際、オルガノイドは、生体内のクリプトの構造組織だけでなく、多くの分子特徴を要約し、正常な生物学や疾患状態を研究するのに有用なツールを提供します。例示するために、オルガノイド研究は、組織再生1、2、3、4、5だけでなく、機能を増強することができる薬物に関与する新しい分子経路を明らかにした病理学的設定6、7で。
腸幹細胞の研究は、腸内層が最も再生性の高い哺乳類組織の一つであるため、特に興味深いものであり、細菌、毒素、およびその他の病原体から生物を保護するために3〜5日ごとに更新する腸の内気。腸幹細胞(ISC)は、この顕著な再生能力を担い、成人幹細胞機能1、2を研究するためのユニークなパラダイムを提供します。マウスの系統トレース実験は、単離されたLgr5陽性幹細胞を培養して、3Dオルガノイドまたは「ミニ腸」をインビトロで生成し、インビボに近い形でそれらが密接にミラーリングできることを実証した。オルガノイド培養はまた、前駆体、ISC、およびパネス細胞からなる腸暗号細胞単離物から導き出され、後者は生体内の上皮ニッチ細胞を構成する。実際、原発性腸暗号細胞からのオルガノイド培養は、広く利用可能な試薬を使用してほとんどの実験室で実装しやすい比較的日常的な技術に進化しています。このモデルはまた、質量分析、免疫組織化学、または免疫蛍光染色2、4、8によるRNAシーケンシング(RNA-Seq)およびタンパク質による遺伝子発現の定量分析にも適している。さらに、機能遺伝学は、機能ゲイン(活性化変異遺伝子の遺伝子過剰発現または発現)または機能喪失(遺伝子サイレンシングまたは機能喪失変異体の発現)アプローチ2を用いて研究することができる。
重要なことに、ポリブレンを用いた標準的なプラスミドDNAまたはウイルス伝達プロトコルの低効率および高毒性は、この分野における大きなハードルのままである。CRISPR/Cas9技術は正確なゲノム編集を可能にしますが、このアプローチでは、シーケンス検証9に続いて時間のかかる選択が必要です。ここでは、磁気ナノ粒子への結合と磁場の応用によりウイルス粒子の送達を最適化する一次腸内オルガノイドのウイルス伝達プロトコルを提示する。以前のプロトコル4、5、10、11、12、13および効率を高めるための推奨事項に対する主要な変更が提供される。また、免疫組織化学または免疫蛍光染色を用いたさらなる分析のために、3Dマトリゲル(以下、地下膜マトリックスまたはマトリックスと呼ばれる)で培養された無傷のオルガノイドから凍結切片を生成するアプローチについても説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
オルガノイドとしての成人腸上皮の一次培養は、幹細胞機能、腸上皮恒常性、病理1、2、3、病理学に関与する分子機構を研究するための強力なツールを提供する。 4.CRISPR/Cas9技術は、遺伝子操作可能なオルガノイド9に使用できますが、所望の遺伝的変化に対する配列解析に基づ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(R01DK102943、R03CA182679、R03CA191621)、メリーランド幹細胞研究基金(2015-MSCRFE-1759、2017-MSCRFD-3934)、米国肺協会、アレニー・ネットワーク・ジョンからの助成金によって支援されました。ホプキンス研究基金とホプキンス消化器病基礎研究センター
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
Referências
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