Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte
Summary
Wir beschreiben Schritt-für-Schritt-Anleitungen zu: 1) effiziente Technische Darmorganoide mit magnetischen Nanopartikeln für lenti- oder retrovirale Transduktion, und, 2) erzeugen gefrorene Abschnitte aus technischen Organoiden. Dieser Ansatz bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Genexpression in Organoiden effizient zu verändern, um nachgelagerte Effekte zu untersuchen.
Abstract
Darmorganoidkulturen bieten eine einzigartige Gelegenheit, Darmstammzell- und Kryptobiologie in vitro zu untersuchen, obwohl effiziente Ansätze zur Manipulation der Genexpression in Organoiden in dieser Arena nur begrenzte Fortschritte gemacht haben. Während die CRISPR/Cas9-Technologie eine präzise Genombearbeitung von Zellen für die Organoiderzeugung ermöglicht, erfordert diese Strategie eine umfassende Auswahl und Einsiebung durch Sequenzanalyse, was sowohl zeitaufwändig als auch kostspielig ist. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur effizienten viralen Transduktion von Darmorganoiden zur Verfügung. Dieser Ansatz ist schnell und hocheffizient, wodurch der Zeit- und Kostenaufwand für die CRISPR/Cas9-Technologie verringert wird. Wir präsentieren auch ein Protokoll zur Erzeugung gefrorener Abschnitte aus intakten Organoidkulturen zur weiteren Analyse mit immunhistochemischer oder immunfluoreszierender Färbung, die zur Bestätigung der Genexpression oder Silencing verwendet werden kann. Nach erfolgreicher Transduktion viraler Vektoren zur Genexpression oder Silencing können Darmstammzell- und Kryptofunktionen schnell beurteilt werden. Obwohl die meisten Organoidstudien In-vitro-Assays verwenden, können Organoide auch an Mäuse für in vivo-Funktionsanalysen geliefert werden. Darüber hinaus sind unsere Ansätze vorteilhaft für die Vorhersage therapeutischer Reaktionen auf Medikamente, da derzeit verfügbare Therapien in der Regel durch Modulation der Genexpression oder Proteinfunktion funktionieren, anstatt das Genom zu verändern.
Introduction
Die Fähigkeit, Maus- oder menschliche Kryptozellen als dreidimensionale (3D) Organoide aus dem Dünndarm oder Dickdarm über längere Zeiträume zu kultitogen, lieferte einen großen Durchbruch, da diese Kulturen in vivo definierende Merkmale des Darmepithels aufweisen. 1 , 2 , 3. Organoide, die aus primären Krypten abgeleitet sind, sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und selbst zu organisationen, und weisen zelluläre Funktionen auf, die ihren Ursprungsgeweben ähneln. Tatsächlich rekapitulieren Organoide nicht nur die strukturelle Organisation von Krypten in vivo, sondern auch viele molekulare Merkmale, wodurch nützliche Werkzeuge zur Untersuchung normaler Biologie und Krankheitszustände zur Verfügung stehen. Zur Veranschaulichung, Organoid-Studien haben neue molekulare Wege in der Geweberegeneration beteiligt 1,2,3,4,5 sowie Medikamente, die die Funktion verbessern könnte in pathologischen Einstellungen6,7.
Die Untersuchung von Darmstammzellen ist von besonderem Interesse, da die Darmschleimhaut zu den höchst regenerativen Säugetiergeweben gehört und sich alle 3-5 Tage erneuert, um den Organismus vor Bakterien, Toxinen und anderen Krankheitserregern innerhalb der Darmlumen. Darmstammzellen (ISCs) sind für diese bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit verantwortlich und bieten somit ein einzigartiges Paradigma für die Untersuchung der adulten Stammzellfunktion1,2. Lineage-Tracing-Experimente an Mäusen zeigten, dass isolierte Lgr5-positive Stammzellen kultiviert werden können, um 3D-Organoide oder “Mini-Guts” in vitro zu erzeugen, wo sie ihre In-vivo-Pendants genau spiegeln. Organoide Kulturen können auch aus Darmkrypta-Zellisolaten abgeleitet werden, die aus Vorläufern, ISCs und Paneth-Zellen bestehen, von denen letztere die epitheliale Nischenzellen in vivo bilden. Tatsächlich hat sich die organoide Kultur aus primären Darm-Kryptozellen zu einer relativ routinemäßigen Technik entwickelt, die in den meisten Laboratorien mit weit verbreiteten Reagenzien einfach umzusetzen ist. Dieses Modell ist auch für die quantitative Analyse der Genexpression durch RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und Proteine durch Massenspektrometrie, Immunhistochemie oder immunfluoreszierende Färbung2,4,8. Darüber hinaus kann die funktionelle Genetik mit Gain-of-Function (Genüberexpression oder Expression eines aktivierenden mutierten Gens) oder Funktionsverlust (Gen-Silencing oder Expression eines Funktionsverlustmutanten) untersucht werden2.
Wichtig ist, dass niedrige Effizienz und hohe Toxizität von Standard-Plasmid-DNA oder viralen Transduktionsprotokollen mit Polybren eine große Hürde auf dem Gebiet bleiben. Obwohl die CRISPR/Cas9-Technologie eine präzise Genombearbeitung ermöglicht, erfordert dieser Ansatz eine zeitaufwändige Auswahl, gefolgt von der Sequenzvalidierung9. Hier stellen wir ein virales Transduktionsprotokoll für primäre Darmorganoide vor, das die Abgabe viraler Partikel durch Konjugation an magnetische Nanopartikel und die Anwendung eines Magnetfeldes optimiert. Wichtige Änderungen an früheren Protokollen4,5,10,11,12,13 und Empfehlungen zur Effizienzsteigerung werden bereitgestellt. Wir beschreiben auch einen Ansatz zur Erzeugung gefrorener Abschnitte aus intakten Organoiden, die in 3D-Matrigel kultiviert sind (daher als Kellermembranmatrix oder -matrix bezeichnet) für die weitere Analyse mit Immunhistochemie oder immunfluoreszierender Färbung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primäre Kultur des adulten Darmepithels als Organoide bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die an der Stammzellfunktion, der intestinalen epitheliale Homöostase und der Pathologie1,2,3, 4. Obwohl die CRISPR/Cas9-Technologie zur Genentwicklung von Organoiden9eingesetzt werden kann, wird sie durch die Notwendigkeit eines umfas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), des Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), der American Lung Association, des Allegheny Health Network – Johns unterstützt. Hopkins Research Fund und das Hopkins Digestive Diseases Basic Research Core Center.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
Referências
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