Este artigo apresenta um método para testar as monosynaptic conexões entre neurônios empregando tetrodotoxina e o canal de sódio tetrodotoxina-resistente, NaChBac.
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Artigo de método
Examinando Monosynaptic conexões em drosófila usando os canais de sódio tetrodotoxina resistente
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aqui, uma nova técnica denominada Tetrotoxin (TTX) Engenharia resistência para sondar as sinapses (TERPS) é aplicada para testar monosynaptic conexões entre os neurônios do alvo. O método baseia-se na expressão co de um ativador de transgênico com o canal de sódio tetrodotoxina-resistente, NaChBac, em um neurônio específico pré-sináptica. Conexões com parceiros pós-sináptica putativos são determinadas por gravações de células inteiras na presença de TTX, que bloqueia a atividade elétrica de neurônios que expressam não NaChBac. Esta abordagem pode ser modificada para funcionar com qualquer ativador ou imagem latente de cálcio como um repórter de conexões. TERPS adiciona o crescente conjunto de ferramentas disponíveis para determinar a conectividade em redes. No entanto, TERPS é o único que relata também confiantemente em massa ou volume transmissão e transmissão de repercussões.
Introdução
Dos principais objetivos da neurociência é mapear as conexões entre os neurônios para entender como a informação flui através de circuitos. Inúmeros recursos e abordagens tornaram-se disponíveis para testar a conectividade funcional entre os neurônios em uma variedade de sistemas de modelo1,2. Para gerar os diagramas de fiação mais precisos usando eletrofisiologia, é importante resolver se observadas as conexões entre duas células são diretos e monosynaptic versus indireta e polysynaptic. Um padrão de ouro para fazer esta distinção nos neurônios de mamíferos é medir a latência entre action potentials único nas....
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Protocolo
1. prepare a moscas e GAL4 identificar linhas de promotor
- Selecione uma linha de promotor GAL4 e cruzá-la com moscas carregando tanto o transgene UAS-NaChBac e um optogenetic transgene para ativação.
Nota: UAS-CsChrimson11 é selecionado devido a sua alta condutância e a facilidade com a qual ele ativa de potenciais de ação mediada por NaChBac. Tanto UAS-NaChBac e CsChrimson-UAS estão disponíveis no repositório de estoques de Bloomington. - Prepare-se como uma solução em etanol (35mm) all-trans retinal e armazenar a solução em congelador a-20 ° C.
- Mix 28 µ l desta unidade populacional em cerca de 5 mL de batata reh....
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Resultados
TERPS é usado para distinguir entre mono e polysynaptic contribuições em conexões sinápticas entre os neurônios. Enquanto fraca estimulação de uma célula pode ser usada para testar conexões diretas, dirigindo a maior atividade pré-sináptica frequentemente recruta polysynaptic conexões (figura 1A). TERPS funciona co, expressando o diferenciação de TTX canal de sódio NaChBac e um ativador de optogenetic e testes de conexões na presença de TTX para eliminar liga.......
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Discussão
Análise TERPS elogios atuais técnicas usadas para circuito rachando, permitindo a detecção de sinapses entre os neurônios identificados. Especificamente, a abordagem revela conexões monosynaptic por silenciar amplamente os potenciais de ação com TTX enquanto restaura a excitabilidade numa população de neurônios com o canal de sódio TTX diferenciação NaChBac selecione. Liberação sináptica é provocada pela estimulação optogenetic enquanto eventos pós-sinápticos são monitorados com gravações de células inteiras. TERPS disti.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer Joshua Singer, Jonathan Schenk, bem como os revisores pensativos para comentários sobre o manuscrito. Também gostaríamos de agradecer a Ben White e Harold Zakon para discussões sobre a técnica. Jonathan Schenk forneceu os dados para a Figura 3A. Este trabalho foi financiado por um subsídio da Fundação Whitehall e um R21 NIH ao QG.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Usado como ativador neural |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Excitabilidade dos resotores em células em TTX |
| Tetrodotoxina | Tochris | 1078 | Pode ser necessária permissão especial para comprar TTX, pois é uma substância controlada |
| todos os trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Requer co-fator para channelrhodopsin |
| Aço Inoxidável 321 Soldável Folha, 0,002" Grosso, 10" Largo | McMaster Carr | 3254K7 | Usado para fazer porta-moscas personalizado. A folha personalizada pode ser cortada a laser a pololu.com a partir do arquivo PDF fornecido |
| Microscópio de Dissecção | Zeiss | Stemi 2000-C | Usado para dissecação de preparação |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Usado durante a dissecção para fixar a mosca na folha |
| Cera de Parafina | Joann | 4917217 | Usado com encerador |
| Número 5 fórceps | Fine Science Tools | #5CO | Usado para dissecação e desmontagem |
| Tesoura de dissecação | Ferramentas de ciência fina | 15001-08 | Usado para remover partes da cutícula durante a dissecação |
| Fio de tungstênio | A-M Systems | 797500 | Use com eletrólise para fazer agulhas afiadas para dissecação |
| Bomba peristáltica reciculante | Simplesmente bombas (Amazon) | PM200S | para recirculação |
| Controlador de velocidade TTX para bomba peristáltica | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller Para Luzes LED ou Fita, 12 Volt 8 Amp,Controlador de Luz de Luz Ajustável DC12V 8A 96W para Led Strip Light B |
| Versa-Mount Regulador de Ar Comprimido de Precisão | McMaster Carr | 1804T1 | Para aplicar pressão positiva durante o patching |
| Vidro capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | Para pipetas de patch |
| Medidor Multiuso | McMaster Carr | 3846K431 | Medidor para regulador de pressão |
| Câmera de Eletrofisiologia | Dage MTI | IR-1000 | Qualquer câmera que funcione na faixa de infravermelho (850 nm) funcionará. Você não quer usar iluminação vermelha, pois isso pode ativar os LEDs IR da csChrimson |
| Thorlabs | M850F2 | Para iluminação oblíqua | |
| fibra óptica para IR LED | Thorlabs | M89L01 | Acopla a |
| lente objetiva IR LED | Olympus 40X | LUMPlanFLN | Isso pode ser usado na maioria dos microscipes e funciona bem para visualizar neurônios de moscas. |
| LED âmbar | Thorlabs | M590L3d | Para visualizar RFP e mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | Para visualizar GFP |
| Conjunto de filtros GFP | Chroma | 49011 | Para visualizar GFP ou estimular channel2rhodopsin |
| Conjunto de filtros mCherry personalizados | Chroma | et580/25x e t600lpxr (do conjunto 49306), mas com uma barreira et610lp/óptica de emissão | Use apenas se desejar corrigir neurônios identificados com channel2rhodopsin |
| Dichroic para combinar Thorlabs de LED âmbar e azul | DMLP550R | Use apenas patch sob mCherry e excite channel2rhodopsin com luz azul. | |
| LED LED vermelhoFornecido | Cree XPE 620 - 630 nm | Usado para acionar o driver de LED csChrimson | |
| LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Usado para acionar LEDs para estimulação optogenética | |
| Manipulador | Sutter Instruments | MP-225 | Usado para posicionar a pipeta durante as gravações |
| Amplificador Patchclamp A-M | Systems | Modelo 2400 | Um amplificador equivalente é adequado |
| Filtro Bessel | Warner Instruments | LPF 202A | Filtro auxiliar usado para filtrar o traço de corrente para o osciloscópio durante o patching. |
| Sistema de Aquisição de Dados | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Usado para gravar dados do amplificador para o computador Bloco de |
| conectores - Terminal BNC BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Usado para conectar o amplificador ao cartão DAQ. |
| Folha de aço | McMaster Carr | 3254K7 | Folha de aço para câmara de gravação personalizada |
| Ímãs | K & J Magnetics | D42 | Para fixar a câmara de gravação ao suporte de anel |
| 1/16" Célula Cast Acrílico Transparente | Pololu | Usado para fazer câmara de gravação personalizada. O acrílico pode ser cortado a laser a pololu.com a partir do arquivo PDF fornecido |
Referências
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal con....
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Reimpressões e permissões
