Examinar las conexiones Monosynaptic en Drosophila utilizando canales de sodio Tetrodotoxin resistentes
Summary
Este artículo presenta un método para probar las conexiones monosynaptic entre neuronas mediante el empleo de tetrodotoxin y el canal de sodio tetrodotoxin resistentes, NaChBac.
Abstract
Aquí, se aplica una nueva técnica denominada Tetrotoxin (TTX) resistencia diseñado para sondeo sinapsis (TERPS) para probar conexiones monosynaptic entre neuronas de destino. El método se basa en la expresión de un activador de transgénico con el canal de sodio tetrodotoxin resistentes, NaChBac, en la neurona presináptica específico. Conexiones con supuestos socios postsinápticos dependen de grabaciones de celulares en presencia de TTX, que bloquea la actividad eléctrica de las neuronas que no expresan NaChBac. Este enfoque puede ser modificado para trabajar con cualquier activador o proyección de imagen de calcio como un reportero de conexiones. TERPS agrega al conjunto creciente de herramientas disponibles para determinar la conectividad en redes. Sin embargo, los TERPS es único en que confiablemente también divulga a granel o transmisión de volumen y derrame transmisión.
Introduction
Una meta importante de la neurociencia es mapear las conexiones entre las neuronas para entender cómo fluye la información a través de circuitos. Numerosos enfoques y recursos se han convertido en disponibles para probar la conectividad funcional entre las neuronas en una gama de modelo sistemas1,2. Para generar los diagramas más precisos utilizando electrofisiología, es importante resolver si las conexiones observadas entre dos células son directos y monosynaptic versus indirecta y polysynaptic. Un estándar de oro para hacer esta distinción en las neuronas mamíferas es medir la latencia entre action potentials solo en las células presinápticas y la aparición de corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) en la segunda neurona. Conexiones monosynaptic deben tener latencias cortas de unos pocos milisegundos y baja variabilidad3. Este enfoque puede ser complicado en invertebrados neuronas porque las sinapsis pueden ocurrir en sus dendritas lejos del sitio de grabación somáticos, provocando retrasos en la detección debido a las distancias largas electrotónicos entre conductancias postsinápticas y la grabación electrodo. Estos retrasos pueden introducir ambigüedad con respecto a poli-versus contribuciones monosynaptic. Además, pequeños eventos sinápticos puede decaer antes de llegar a la página grabaciones somática y conducir la actividad presináptica más fuerte, es probables que contratar eventos polysynaptic.
Han desarrollado varias técnicas para probar las conexiones monosynaptic en invertebrados. Un método utiliza soluciones de cationes divalentes alta (Hi-Di) que contiene exceso de magnesio++ y Ca++. Esta solución bloquea conexiones polysynaptic reduce probabilidad de liberación y aumento umbral potencial de acción a favor de la detección de monosynaptic entrada4,5. Determinar la proporción exacta de Mg++ ++ de CA requiere, sin embargo, no es trivial y polysynaptic contribuciones pueden persistir incluso modesta estimulación6. Un enfoque alternativo denominado reconstitución GFP a través de socios sináptica (GRASP) aprovecha la proximidad entre las membranas previas y postsinápticas en sinapsis para inferir una conexión monosynaptic 7. Aquí, un componente de la proteína verde fluorescente (GFP) se expresa en una neurona, y el fragmento complementario de la molécula se expresa en un supuesto socio postsináptico. La presencia de fluorescencia indica que las dos neuronas están lo suficientemente cerca para permitir la reconstitución de la molécula GFP e implica la existencia de sinapsis. ASIMIENTO puede Informe sinapsis falso, sin embargo, si dos celdas han estrechamente apposed membranas, como en un nervio o fascículo. Variantes del asimiento de eliminan tales falsos positivos por atar el presináptico fragmento de GFP directamente a synaptobrevin, permitiendo así la reconstitución solamente en sinapsis activa8. Mientras que asimiento y sus variantes han sido instrumentales en la determinación de conectividad funcional en la Drosophila del CNS, algunas conexiones pueden no hacerse visibles por comprensión si las distancias entre los socios pre- y postsinápticas es relativamente grande. Esto es particularmente pertinente en la evaluación de la transmisión de volumen asociada a neuromodulación9 o GABAérgicas inhibición10.
Aquí, se demuestra una técnica complementaria y novedosa para probar conexiones monosynaptic directas en Drosophila del CNS. Este método, llamado tetrodotoxina resistencia diseñado para sondeo sinapsis (TERPS), funciona por la coexpresión de la tetrodotoxina (TTX)-canal sodio resistente, NaChBac y un activador de optogenetic en una célula presináptica durante la grabación de la supuesta socios postsynaptic9. En presencia de TTX, se suprime toda actividad mediada por el potencial de acción en células distintas de las que NaChBac. El canal de NaChBac selectivamente restaura la excitabilidad en las celdas presinápticos específicos, permitiendo la transmisión sináptica evocada por la luz. Este método permite la fuerte activación de las neuronas presinápticas, tal que las conexiones se pueden resolver postsynaptically somática grabación mientras reduce la probabilidad de contratar circuitos polysynaptic. Importante, esta técnica permite el estudio de la transmisión de volumen y revela la difusión del transmisor liberado de una sola neurona a lo largo de un circuito. Además, los TERPS puede revelar la naturaleza química de la conexión a través de la farmacología convencional. TERPS es conveniente para el uso en cualquier modelo de sistema que permite la expresión transgénica de los canales de sodio TTX-insensible.
Protocol
Representative Results
Discussion
Análisis TERPS complementan técnicas actuales utilizadas para circuito agrietarse permitiendo la detección de las sinapsis entre las neuronas identificadas. Específicamente, el enfoque revela conexiones monosynaptic por silenciamiento ampliamente los potenciales de acción con TTX restableciendo la excitabilidad en una población selecta de neuronas con el canal de sodio TTX-insensible NaChBac. Liberación sináptica se produce por el estímulo de optogenetic mientras que eventos postsinápticos son monitoreados con …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Joshua Singer, Jonathan Schenk, así como revisores pensativos por comentarios en el manuscrito. También nos gustaría agradecer a Ben White y Harold Zakon debates sobre la técnica. Jonathan Schenk proporciona los datos de la Figura 3A. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación de Whitehall y un R21 de NIH a QG.
Materials
| UAS-csChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55135 | Used as a neural activator |
| UAS-NaChBac | Bloomington Drosophila Stock Center | 9466 | Resotores excitibility in cells in TTX |
| Tetrodotoxin | Tochris | 1078 | Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance |
| all trans-Retinal | Sigma-Aldrichall trans-Retinal | R2500 | Require co-factor for channelrhodopsin |
| Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide | McMaster Carr | 3254K7 | Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | Used for dissection of preparation |
| Waxer | Almore | Eectra Waxer 66000 | Used during dissection to secure fly in foil |
| Paraffin Wax | Joann | 4917217 | Used with waxer |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | #5CO | Used for dissection and desheathing |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | Used to remove parts of the cuticle during dissection |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797500 | Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection |
| Reciculating Peristaltic Pump | Simply Pumps (Amazon) | PM200S | for recirculating TTX |
| Speed Controller for peristaltic pump | Zitrades (Amazon) | N/A | PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B |
| Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator | McMaster Carr | 1804T1 | For applying positive pressure during patching |
| Glass capilaries | World Precision Instruments | TW150F-3 | For patch pipettes |
| Multipurpose Gauge | McMaster Carr | 3846K431 | Gauge for pressure regulator |
| Electrophysiology Camera | Dage MTI | IR-1000 | Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson |
| IR LED | Thorlabs | M850F2 | For oblique illumination |
| fiber optic for IR LED | Thorlabs | M89L01 | Couples to IR LED |
| Objective lens | Olympus 40X | LUMPlanFLN | This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons. |
| Amber LED | Thorlabs | M590L3d | For visualizing RFP and mCherry |
| Blue LED | Thorlabs | M470L3d | For visualizing GFP |
| GFP filter set | Chroma | 49011 | For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin |
| Custom mCherry Filter Set | Chroma | et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic | Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin |
| Dichroic to combine Amber and blue LED | Thorlabs | DMLP550R | Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light. |
| Red LED | LEDSupply | Cree XPE 620 – 630 nm | Used to drive csChrimson |
| LED Driver | LEDSupply | 3021-D-E-1000 | Used to drive LEDs for optogenetic stimulation |
| Manipulator | Sutter Instruments | MP-225 | Used to position pipette during recordings |
| Patchclamp Amplifier | A-M Systems | Model 2400 | An equivalent amplifier is suitable |
| Bessel Filter | Warner Instruments | LPF 202A | Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching. |
| Data Acquisition System | National Instruments | NI PCIe-6321 781044-01 | Used to record data from amplifier to computer |
| Connector Block – BNC Terminal BNC-2090A | National Instruments | 779556-01 | Used to connect amplifier to DAQ card. |
| Steel Foil | McMaster Carr | 3254K7 | Steel foil for custom recording chamber |
| Magnets | K&J Magnetics | D42 | To secure recording chamber to ring stand |
| 1/16" Cell Cast Acrylic Clear | Pololu | Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file |
Referências
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