Respirometria de alta resolução para medir a função mitocondrial das células-Beta intacto na presença de compostos naturais
Summary
O objetivo do presente protocolo é medir o efeito da glicose mediada por alterações de respiração mitocondrial na presença de compostos naturais intactos 832/13 beta células usando respirometria de alta resolução.
Abstract
Respirometria de alta resolução permite a medição do consumo de oxigênio de mitocôndrias isoladas, células e tecidos. As células beta desempenham um papel fundamental no corpo por controlar níveis de glicose no sangue através da secreção de insulina em resposta a concentrações elevadas de glicose. A secreção de insulina é controlada pelo metabolismo da glicose e respiração mitocondrial. Portanto, medir a respiração celular intacta de beta é essencial para ser capaz de melhorar a função da célula beta como um tratamento para o diabetes. Usar intacta 832/13 INS-1 derivado de células beta, podemos medir o efeito do aumento da concentração de glicose na respiração celular. Este protocolo permite-nos medir a respiração celular beta na presença ou ausência de vários compostos, permitindo que se determine o efeito de dado compostos na respiração celular intacta. Aqui vamos demonstrar o efeito de dois compostos naturais, epicatequina monomérica e curcumina, na célula beta respiração sob a presença de condições de glicose elevada (16,7 mM) ou baixo (2,5 mM). Esta técnica pode ser usada para determinar o efeito de vários compostos na respiração celular intacta de beta na presença de diferentes concentrações de glicose.
Introduction
O objetivo principal da célula beta pancreática é manter o sistema normoglycemia, através da secreção de insulina glicose-estimulado. As células beta sentir mudanças fisiológicas em circulação glicose em grande parte devido a baixa afinidade, transportador de glicose alta capacidade GLUT2 (Glucose Transporter 2, Km 16,7 mM)1. Como aumento dos níveis de glicose circulatório, este transporte de baixa afinidade de alta capacidade facilita um aumento proporcional de glicose intracelular dentro da célula beta. Glicose é metabolizada através da glicólise, o ciclo de TCA (ciclo do ácido cítrico) e respiração mitocondrial, resultando em elevados níveis celulares de ATP (adenosina trifosfato). A elevada concentração de ATP bloqueia os canais de K+ sensíveis ATP, resultando em despolarização da membrana. Despolarização da membrana provoca a abertura de canais de tensão Ca2 + e subsequente liberação de vesículas limite de grânulos de insulina2. Disfunção da célula beta é uma marca registrada de Diabetes tipo 2 (T2D) e resulta na secreção de insulina diminuída e mal controlado e, finalmente, a morte de células beta3. Mecanismos que mantêm ou melhorar a função da célula beta podem ser usados como um tratamento para T2D.
Estudos têm demonstrado os efeitos benéficos de ocorrência natural compostos à base de plantas em células pancreáticas do beta4. Estes compostos podem ter seu efeito através da crescente proliferação de células beta, sobrevivência ou a secreção de insulina glicose-estimulada. Por exemplo, estudos recentes têm demonstrado que epicatequina monomérica aumenta a secreção de insulina glicose-estimulada, aumentando a respiração mitocondrial e ATP celular a aumentar os níveis de5. Portanto, compreender como esses compostos podem aumentar funcional de células beta em massa é importante para alavancar estes compostos como terapêutica potencial.
Respiração celular pode ser medida através de um número de ferramentas. Uso de um respirometer de alta resolução permite a titulação de moduladores químicos para uma população de célula intacta ou permeabilized6. Esta ferramenta permite a adição de vários compostos, em diferentes concentrações, dando assim uma grande variedade de informações.
Dada a conexão íntima entre o metabolismo da glicose e função da célula beta, medições de respiração celular são críticas. Medições da respiração celular podem ser feitas usando permeabilized ou intactas as células beta, com cada um que tem seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens de7,8. Enquanto permeabilização de células beta permite medir diferentes aspectos da cadeia de transporte de elétrons, fá-lo sem cumprimentos para o mecanismo de indução de respiração na célula beta, absorção de glicose e metabolismo. Portanto, o uso da respiração celular de beta unpermeabilized é uma técnica muito útil para determinar a resposta de células beta para vários níveis de glicose, usando o consumo de oxigênio como a leitura.
O objetivo desta técnica é medir o consumo de oxigênio em intacta INS-1 derivado de células beta de 832/13. Esta técnica nos permite determinar a resposta das células beta às condições unstimulatory glicose (glicose 2,5 mM) bem como condições estimulatórios glicose (glicose 16,7 mM). Enquanto as células unpermeabilized não nos permitem testar individualmente complexo I, II ou III do elétron da cadeia de transporte, a técnica que permite medições lidando com respiração de inibição (A oligomicina), desacoplada complexa IV (FCCP-carbonila cianeto- 4– phenylhydrazone (trifluorometoxi)) e completamente inibida a respiração (A Antimycin). Este estudo demonstra a eficácia da respiração em intactas unpermeabilized células-beta do pâncreas, bem como o efeito de dois compostos naturais, epicatequina monomérica e curcumina, na respiração celular beta de medição.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objectivo do presente protocolo é usar respirometria de alta resolução para medir as taxas respiratórias em células-beta do pâncreas intactas. Este método permite a medição da resposta célula beta à glicose aumento níveis. O protocolo também permite o tratamento prévio com vários compostos, como demonstrado no presente protocolo com o natural monomérico epicatequina ou curcumina4,5. Tratamento com vários outros …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer os membros dos laboratórios Tessem e Hancock para assistente e discussão científica. Os autores agradecer Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) para fornecer a fração de monômero de cacau epicatequina derivada. Este estudo foi suportado por uma concessão da Fundação de educação e pesquisa-ação Diabetes de JST.
Materials
| O2k Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Instrument for high-resolution respirometry |
| DatLab 6 Program | Oroboros Instruments | 27141-01 | Computer program for analysing high-reolution respirometry |
| INS-1 832/13 cell line | Duke University Medical Center | NONE | Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard |
| Curcumin | Sigma | C7727 | Pre-treatment of beta cells |
| Cocoa epicatechin monomer | Virginia Polytechnic Institute and State University | NONE | Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson |
| Trypsin | Sigma | T4049 | For cell culture |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | 832/13 beta cell media |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | 832/13 beta cell media component |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4458 | 832/13 beta cell media component |
| HEPES | Sigma | H3662 | 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer |
| Glutamine | Caisson | GLL01 | 832/13 beta cell media component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | 832/13 beta cell media component |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | 832/13 beta cell media component |
| NaCl | Fisher | S271 | Component of 10x SAB buffer |
| KCl | Sigma | P9541 | Component of 10x SAB buffer |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Component of 10x SAB buffer |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | Component of 10x SAB buffer |
| D-(+)-Glucose Solution | Sigma | G8769 | Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of 1x SAB buffer |
| 35% BSA Solution | Sigma | A7979 | Component of 1x SAB buffer |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Component of 1x SAB buffer |
| 200 proof ethanol | Sigma | 459844 | Washing Oxygraph O2k Chambers |
| Oligomycin A | Sigma | O4876 | Chemicals for respiration assay |
| FCCP | Sigma | C2920 | Chemicals for respiration assay |
| Anitmycin A | Sigma | A8674 | Chemicals for respiration assay |
| BCA Protein Kit | Thermo Fisher | 23225 | For determining protein concentration |
Referências
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