天然化合物の存在下でそのまま β 細胞のミトコンドリア機能を測定するための高解像度の呼吸
Summary
このプロトコルの目的は、高解像度の呼吸を使用してそのまま 832/13 ベータ細胞に及ぼす天然化合物の存在下でのミトコンドリアの呼吸にグルコース依存性の変化を測定するためです。
Abstract
高解像度の呼吸は、分離ミトコンドリア、細胞、組織の酸素消費量の測定が可能です。Β 細胞は、高グルコース濃度に応じてインスリン分泌を制御血糖レベルが体内で重要な役割を果たします。インスリン分泌は、糖代謝とミトコンドリアの呼吸によって制御されます。したがって、そのまま β 細胞呼吸を測定する糖尿病の治療として β 細胞機能を改善することが不可欠です。Β 細胞の細胞呼吸のグルコース濃度の増加の効果を測定することができますを派生そのまま 832/13 プラグイン-1 を使用します。このプロトコルは、ベータ細胞の呼吸を可能にする効果を決定する種々 の化合物の存在の有無で測定することができますそのまま細胞の呼吸に化合物を与えられました。低 (2.5 mM) または高グルコース (16.7 mM) の条件の存在下で β 細胞呼吸に及ぼすクルクミン、エピカテキン単量体、2 つの自然発生する化合物を示します。この手法は、様々 な化合物が異なるグルコース濃度の存在下でそのまま β 細胞呼吸に及ぼす影響を決定する使用できます。
Introduction
膵臓のベータ細胞の主な目的は、グルコース刺激によるインスリン分泌を介してシステムな場合を維持することです。Β 細胞感覚主低親和性、高容量グルコーストランスポーター GLUT2 によりブドウ糖の循環の生理学的変化 (ブドウ糖トランスポーター 2、Km 16.7 mM)1。循環のブドウ糖のレベルの上昇とこの高容量低親和性トランスポーターは β 細胞内でブドウ糖を細胞内に比例して増加を促進します。グルコースは解糖系、TCA サイクル (トリカルボン酸) 細胞 ATP (アデノシン三リン酸) レベルの上昇で、その結果ミトコンドリア呼吸代謝されます。高架の ATP 濃度は ATP 敏感な K+チャネル、膜の脱分極の結果をブロックします。膜の脱分極を引き起こす電圧依存性 Ca2 +チャネルの開口部と小胞の後続のリリース バインド インスリン顆粒2。Β 細胞機能不全を示し、低下し、コントロール不良インスリン分泌と最終的には β 細胞死3(T2D) 2 型糖尿病の特徴です。ダグラス T2D 用治療薬として維持または β 細胞機能を改善するメカニズムを使用できます。
研究は、天然の有益な効果を示している膵 β 細胞4植物化合物。これらの化合物増加 β 細胞の増殖、生存、またはグルコース刺激によるインスリン分泌に効果があります。例として、最近の研究は、エピカテキン単量体ミトコンドリア呼吸の増加を介してのグルコース刺激によるインスリン分泌を高め、レベル5の細胞の ATP を増加を実証しています。したがって、これらの化合物は機能の β 細胞を増やすことができますどのように理解質量は潜在的な治療としてこれらの化合物を活用することが重要です。
細胞呼吸は、ツールの数を測定できます。高解像度計グリセリンまたはそのままのセル人口6化学変調器の滴定の使用します。このツールは、このように幅広い情報を与える異なる濃度で様々 な化合物の添加を許可します。
糖代謝と β 細胞機能との間に親密な関係を考えると、細胞呼吸の測定が重要です。細胞呼吸の測定を行うことができます独自の利点と欠点の7,8のセットを持っているそれぞれのグリセリンまたは無傷のベータ細胞を使用して。Β 細胞の透過電子輸送チェーンのさまざまな側面を測定することができます、なしで β 細胞は、グルコース取り込み代謝呼吸を誘発するメカニズムに関しては。したがって、unpermeabilized のベータ細胞の呼吸の使用は、読み出しとして酸素消費量を使用して様々 な血糖値のレベルに対する β 細胞の応答を判断する非常に有用なテクニックです。
この手法の目的は、そのまま INS 1 の酸素消費量を測定する派生 832/13 β 細胞です。この手法では、条件刺激グルコース (ブドウ糖 16.7 mM) だけでなく、unstimulatory グルコース条件 (2.5 mM グルコース) に対する β 細胞の応答を判断出来ます。Unpermeabilized 細胞を私たちは複合体を個別にテストすることはできません私は、II または III の電子輸送チェーン、手法が複雑な IV 阻害 (オリゴマイシン A) 非呼吸 (FCCP カルボニル シアン化物 – を扱う測定を許可4-(フッ素系低分子) phenylhydrazone)、呼吸 (アンチマイシン A) を完全に抑制します。本研究は、2 つの自然発生する化合物、エピカテキン単量体とクルクミン、β 細胞呼吸に及ぼす影響と同様に、そのまま unpermeabilized 膵 β 細胞における呼吸の測定の有効性を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの目的は、高解像度の呼吸を使用してそのまま膵 β 細胞における呼吸速度を測定することです。このメソッドは、高められたブドウ糖のレベルに β 細胞応答の測定できます。プロトコルは、この自然に発生する単量体エピカテキンやクルクミン4,5プロトコルで示されて様々 な化合物の前処理でできます。?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、アシスタントと科学的な議論について Tessem とハンコックのラボのメンバーに感謝したいと思います。著者は、アンドリュー ・ ニールソン博士 (バージニア工科大学) がココア派生エピカテキン単量体の一部を提供することをありがちましょう。本研究は、JST に糖尿病アクション ・ リサーチと教育財団からの助成金によって支えられました。
Materials
| O2k Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Instrument for high-resolution respirometry |
| DatLab 6 Program | Oroboros Instruments | 27141-01 | Computer program for analysing high-reolution respirometry |
| INS-1 832/13 cell line | Duke University Medical Center | NONE | Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard |
| Curcumin | Sigma | C7727 | Pre-treatment of beta cells |
| Cocoa epicatechin monomer | Virginia Polytechnic Institute and State University | NONE | Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson |
| Trypsin | Sigma | T4049 | For cell culture |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | 832/13 beta cell media |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | 832/13 beta cell media component |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4458 | 832/13 beta cell media component |
| HEPES | Sigma | H3662 | 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer |
| Glutamine | Caisson | GLL01 | 832/13 beta cell media component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | 832/13 beta cell media component |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | 832/13 beta cell media component |
| NaCl | Fisher | S271 | Component of 10x SAB buffer |
| KCl | Sigma | P9541 | Component of 10x SAB buffer |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Component of 10x SAB buffer |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | Component of 10x SAB buffer |
| D-(+)-Glucose Solution | Sigma | G8769 | Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of 1x SAB buffer |
| 35% BSA Solution | Sigma | A7979 | Component of 1x SAB buffer |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Component of 1x SAB buffer |
| 200 proof ethanol | Sigma | 459844 | Washing Oxygraph O2k Chambers |
| Oligomycin A | Sigma | O4876 | Chemicals for respiration assay |
| FCCP | Sigma | C2920 | Chemicals for respiration assay |
| Anitmycin A | Sigma | A8674 | Chemicals for respiration assay |
| BCA Protein Kit | Thermo Fisher | 23225 | For determining protein concentration |
Referências
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