密度梯度离心法分离小鼠原发胶质细胞的研究
Summary
本文提出了一种从小鼠脑中分离原发胶质细胞的方法。这种技术有助于促进目前对神经系统状况的理解。将密度梯度离心和磁分离相结合, 产生高纯样品的充分屈服。此外, 我们概述了小胶质细胞的表征步骤。
Abstract
小胶质细胞, 是大脑中的驻留免疫单元, 是中枢神经系统炎症或损伤的第一反应者。最近的研究发现小胶质细胞是动态的, 能够同时承担炎症和抗炎的表型。两种 M1 (亲炎症) 和 M2 (支持修复) 表型在诸如围产期脑损伤等 neuroinflammatory 条件下起着重要作用, 并表现出不同的功能, 以应对某些环境刺激。胶质激活的调节已被注意到赋予神经保护, 因此提示小胶质细胞可能有治疗潜力的脑损伤。然而, 需要更多的研究, 以更好地了解小胶质细胞在疾病中的作用, 这项议定书有利于这一点。下面描述的协议结合了密度梯度离心过程, 以减少细胞碎片, 与磁性分离, 产生一个高度纯净的主要胶质细胞样本, 可用于体外实验, 没有需要2-3 周的培养。此外, 这些表征步骤产生了关于小胶质细胞的强健的功能数据, 帮助研究, 以更好地了解这两种干细胞的极化和启动, 这在再生医学领域具有很强的意义。
Introduction
围产期期间从炎症、缺氧缺血性和出血中获得的损伤可以有一系列的长期后遗症。围产期脑损伤的复杂病理生理学理论涉及炎症和缺血与随后的神经和轴突死亡1。先天免疫应答在导致伤害的一连串事件中起重要作用2。
小胶质细胞, 中枢神经系统 (CNS) 内的居民免疫单元, 是伤害3的第一个应答者。小胶质细胞是具有保护或毒性能力的塑料电池类型, 依赖于环境4。它们参与趋化、吞噬、抗原表达和细胞因子的产生和活性氧种类的4,5。衰老小胶质细胞不断地对环境进行调查, 并由异物或有害物质的存在4激活。激活会导致一种支持炎症的响应, 在 CNS 保护4中至关重要。这些 M1 的 “亲炎” 表型小胶质细胞主要参与抗原表示和病原体的死亡4。尽管炎症反应在神经保护中起着关键作用, 但不受控制或长时间的炎症可能有害, 导致神经元损伤4。然而, 当暴露在某些环境刺激, 小胶质细胞可以表现出一种抗炎的表型。这些支持修复的 M2 小胶质细胞在伤口愈合和修复过程中具有关键作用6, 释放出一系列 downregulate 炎症、增加吞噬功能和促进修复4, 7. 小胶质细胞的作用多种多样, 包括在髓鞘形成中驱动少突胶质分化 8, 在中风模型的氧和葡萄糖耗尽期间保护神经元9并促进突起在脊髓损伤模型10。
对这些胶质细胞的研究是理解和操作 neuroinflammation 反应的一个重要方面。所述的协议允许进一步研究小胶质细胞调制在 neuroinflammatory 疾病中的治疗潜力。
胶质激活对神经保护角色的调制被观察到了一系列条件11,12,13。因此, 提高当前的理解和进一步研究胶质激活的调制是至关重要的, 需要使用包括体外和体内在内的各种模型。体外研究是一种重要的工具, 因为它们具有更高的效率、更低的成本和调查孤立细胞群体的能力。
文献中描述了一系列的协议, 用于从小鼠脑中分离小胶质细胞, 从而有效地生产出高产样品, 具有良好的生存能力和高纯度。常见的小胶质细胞的分离方法是通过磁分离和长时间晃动的混合胶质细胞培养。通过个人经验发现, 有很大程度的细胞碎片阻碍了磁柱。因此, 使用了下面的协议, 其中包括初始密度梯度离心步骤后, CD11b 磁分离。下面描述的协议已经过优化, 以产生足够数量的高度纯样本。它是有利的由于它的高纯度和短的时间周期-你可以在2天内进行化验, 而无需培养2-3 周。该协议有可能被改编为小鼠星形胶质细胞的分离。
Protocol
Representative Results
Discussion
小胶质细胞具有支持和抗炎的能力, 通过环境刺激改变。先前的研究表明, 小胶质细胞活化的调节可以赋予神经保护作用。他们为神经元提供保护和修复损伤的能力需要更多的研究来进一步了解这些复杂细胞的现状。因此, 高纯度原发性小胶质细胞的分离是一项重要而有用的技术。这是一个相对较快的方法, 获得高纯度的主要小胶质细胞为体外实验在2天内准备好。
文献?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
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