Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים
Summary
שיטה מתוארת עבור fractionation של מינים huntingtin מוטציה לא מסיסים ולא מסיסים מתרבות המוח ותא העכבר. השיטה המתוארת שימושית עבור כימות של huntingtin חלבון השטף ועזרי בניתוח הומאוסטזיס חלבון בפתוגנזה של המחלה, בנוכחות לפליטת ואפיון
Abstract
ההצטברות של חלבונים misfolded הוא מרכזי פתולוגיה של מחלת הנטינגטון (HD), רבים הפרעות ניווניות אחרות. באופן ספציפי, מפתח תכונה פתולוגית של HD הוא הצטברות חריגה של מוטציה בחלבון HTT (mHTT) לתוך מתחמי משקל מולקולרי גבוה, גופים הכללה תאיים המורכב מקטעי וחלבונים אחרים. שיטות קונבנציונליות כדי למדוד ולהבין שהתרומות של צורות שונות של אגרגטים המכילות mHTT כוללים קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, ניתוח תספיג מסנן השמנה מבחני.
עם זאת, רוב השיטות האלה הן קונפורמציה ספציפיים, ולכן לא יכול לפתור המדינה מלאה של mHTT השטף חלבון בשל האופי המורכב של צבירה מסיסות והרזולוציה.
לצורך זיהוי mHTT צבורים שונים צורות ששונה ואת מתחמי, ההפרדה ואת solubilization של אגרגטים הסלולר ואת שברי הוא חובה. כאן אנו מתארים שיטה כדי לבודד והמחש mHTT מסיסים מונומרים, oligomers, שברים, משקל מולקולרי גבוה (HMW) לא מסיסים שנצבר mHTT מינים. HMW mHTT שירים עם התקדמות המחלה, מתכתב עם העכבר התנהגות הקריאות הבאות, יש כבר מווסת לטובה על ידי התערבויות טיפוליות מסוימת1. גישה זו יכולה לשמש עם מוח העכבר רקמות היקפיים, תרבית תאים אבל שעשוי להיות מותאם דגם מערכות או מחלת בהקשרים אחרים.
Introduction
שיבוש רשתות בקרת איכות חלבון להבטיח קיפול נאות והשפלות של החלבונים הוא מרכזי סביר פתולוגיה מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), אחרים “חלבון misfolding” והפרעות2,3. הבנה מפורטת של רכיבי הרשת פרוטוסטאזיס ותרומתם פתולוגיה ולכן הם חיוניים לפיתוח התערבויות טיפוליות משופרת. HD נגרמת על ידי הרחבת חריג שידור חוזר חטיבתי בתוך הגן HD וכתוצאה מכך רצועת המורחב של polyglutamines (polyQ) חלבון huntingtin (HTT)4. תכונה פתולוגית עקבית של פתוגנזה HD היא וכתוצאה מכך misfolding, הצטברות, צבירה של HTT באזורים של המוח, ברקמות היקפיים, אשר הוכח להתערב במספר דרכים עם תאים נורמליים הומאוסטזיס ותפקוד 5 , 6. HTT בזמן מבוטא ubiquitously, בינוני קוצני נוירונים בסטריאטום פגיע באופן סלקטיבי, המושפע ביותר בגלוי עם ניוון קליפתי הבולטים המשויכים גם HD פתוגנזה.
היווצרות של אגרגטים של HTT במוח של חולים HD ומודלים בעלי חיים שימש בדרך כלל proxy סמן התקדמות המחלה ולהשיג דומיננטה-שלילי של פונקציה mHTT7. למרות המנגנון המדויק על ידי שבו חלבון misfolding, צבירת עשוי לתרום רעילות הנגרמת mHTT אינן ברורות, היווצרות של אלה תכלילים במוח של חולי HD, מודלים שונים היא תכונה קבוע ובלתי נמנע. תכלילים מופיעות כמורכבת במידה רבה של קטעים HTT שהצטברו המכיל N-מסוף מורחבת polyQ, המציין את proteolysis, וכן עיבוד של HTT באורך מלא, כמו גם אלטרנטיבה שחבור8,9 עשוי לשחק תפקיד חשוב בפתוגנזה של שברי HD. N-מסוף HTT עלולה להוות צורה פיפטות של HTT יכול לצבור במהירות, nucleate, ו להאיץ או להפיץ את תהליך של צבירת10.
עם זאת, הנוכחות של תכלילים אלה לא בהכרח לתאם עם רעילות HTT-induced או מוות תא11. HTT הוצע לעבור תהליך צבירת מ מונומר מסיסים דרך מינים oligomeric מסיסים ו β-גיליון הסיבים לא מסיסים אגרגטים, תכלילים12. פתרון אלה מינים שונים של חלבון באמצעות מבחני הביוכימי רגיל כבר אתגר בשטח עקב יציבות שלהם במאגר נמוך חומרי פירוק ולקשיי להמחיש באמצעות מבחני הביוכימי סטנדרטי. לפיכך, שיקולים מתודולוגי הם קריטיים באיתור את התואר ואת התבנית של mHTT המצטבר של צבור.
פרוטוקול המובאת כאן מספק שיטה כדי להמחיש כמה intermediates של HTT, במיוחד היווצרות של זן HMW HTT לא מסיסים המופיע לעקוב מקרוב אחר עם HD בפתוגנזה של המחלה התקדמות1,13 ,14. היכולת לזהות ולעקוב אחר מספר מינים של mHTT מספק חוקרים כלי הביוכימי ללמוד בפתוגנזה של המחלה ואף להעריך את פוטנציאל התערבויות טיפוליות דרך שלהם אפנון ואת ההשפעה על המחלה פתוגנזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמה אמצעי זהירות נדרשים עבור הפרוטוקולים לעיל להבטיח תוצאות עקביות, תפוקה. ראשית, mHTT שני שברים באופן ספונטני יהוו אגרגטים לאורך זמן על מחזורי הפשרת ההקפאה מרובים, במיוחד כאשר אתה נמצא ריכוז גבוה. לפיכך חיוני כדי להקפיא aliquots של חלבון preps, ולאחר להפשיר רק את אמצעי האחסון הדרושים לפני הפעלת וז…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH (RO1-NS090390). כן נרצה להודות דיון במהלך פיתוח assay זה וסיוע טכני ד ר ג’ואן Steffanfor.
Materials
| Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
| 1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
| Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
| DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
| Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
| 20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
| Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
| Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
| Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
| Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |
Referências
- Ochaba, J., et al. PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington’s Disease-Associated Phenotypes In Vivo. Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).
- La Spada, A. R., Taylor, J. P. Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis. Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).
- Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. Genetics and neuropathology of Huntington’s disease. Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).
- The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. Huntington’s disease: the current state of research with peripheral tissues. Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).
- Weydt, P., et al. Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington’s disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington’s disease neurodegeneration. Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).
- Schulte, J., Littleton, J. T. The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington’s Disease pathology. Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).
- Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington’s disease pathogenesis. RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).
- Neueder, A., et al. The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington’s disease patients. Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).
- Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington’s disease. Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).
- Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell. 95 (1), 55-66 (1998).
- Kim, S., Kim, K. T. Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington’s Disease. Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).
- O’Rourke, J. G., et al. SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).
- Shibata, M., et al. Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1. J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).
- Apostol, B. L., et al. A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- Sontag, E. M., et al. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).
- Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
- Sontag, E. M., et al. Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington’s disease models. J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).
- Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons. BMC Neurosci. 10, 73 (2009).
- Shahmoradian, S. H., et al. TRiC’s tricks inhibit huntingtin aggregation. Elife. 2, e00710 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation. J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).
- Goldberg, N. R. S., et al. Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies. Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).
