En metode er beskrevet til fraktionering af uopløselige og opløselige mutant huntingtin arter fra mus hjernen og celle kultur. Den beskrevne metode er nyttig til karakterisering og kvantificering af huntingtin protein flux og aids i at analysere protein homøostase i sygdom patogenese og perturbationer
Ophobning af fejlfoldede proteiner er central for patologi i Huntington’s chorea (HD) og mange andre neurodegenerative lidelser. Specifikt, en patologisk nøglefunktionerne i HD er afvigende ophobning af mutante HTT (mHTT) protein i høj molekylvægt komplekser og intracellulære optagelse organer består af fragmenter og andre proteiner. Konventionelle metoder til at måle og forstå bidrag af forskellige former for mHTT-holdige aggregater indeholde Fluorescens mikroskopi, western blot analyse og filter fælde assays.
Men de fleste af disse metoder er kropsbygning specifikke, og derfor kan ikke løse den fuld tilstand af mHTT protein flux på grund af den komplekse karakter af samlede opløselighed og opløsning.
For identifikation af aggregerede mHTT og forskellige ændrede former og komplekser er adskillelse og oploesning af cellulære aggregater og fragmenter obligatorisk. Beskriver her vi en metode til at isolere og visualisere opløselige mHTT, monomerer, oligomerer, fragmenter, og en uopløselig høj molekylvægt (HMW) akkumuleret mHTT arter. HMW mHTT spor med sygdomsprogression, svarer med musen adfærd udlæsninger, og har været gavnlig moduleres af visse terapeutiske indgreb1. Denne fremgangsmåde kan kun bruges med mus hjernen, perifere væv og cellekultur men kan tilpasses andre modelsystemer eller sygdom sammenhænge.
Afbrydelse af protein kvalitetskontrol netværk, der sikrer korrekt falsning og nedbrydning af cellulære proteiner er sandsynligvis central til patologi i Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom (PD), Huntington’s chorea (HD), og andre “protein misfoldning” lidelser2,3. En detaljeret forståelse af proteostasis netværk komponenterne og deres bidrag til patologi er derfor afgørende at udvikle forbedrede terapeutiske indgreb. HD skyldes en unormal udvidelse af en CAG-gentagelse inden for HD-genet, som resulterer i en udvidet strækning af polyglutamines (polyQ) i huntingtin (HTT) protein4. En konsekvent patologiske funktion af HD patogenesen er den resulterende misfoldning, akkumulering og sammenlægning af HTT i regioner af hjernen og i perifere væv, som har vist sig at blande sig på flere måder med normal celle homøostase og funktion 5 , 6. mens HTT udtrykkes allestedsnærværende, mellemstore spiny neuroner i striatum er selektivt sårbare og mest åbenlyst ramte med bemærkelsesværdige kortikal atrofi også forbundet med HD patogenese.
Dannelsen af aggregater af HTT i hjernen hos HS-patienter og dyremodeller har typisk serveres som en proxy markør for sygdomsprogression og dominerende-negativ forstærkning af funktion for mHTT7. Selvom de præcise mekanismer ved hvilke protein misfoldning og sammenlægning kan bidrage til mHTT-induceret toksicitet er fortsat uklart, er dannelsen af disse optagelser i hjernen af HC-patienter og forskellige dyremodeller en invariant og uundgåelige funktion. Optagelser vises at være består stort set af akkumulerede HTT fragmenter der indeholder N-terminalen udvidet polyQ, der angiver at proteolyse og forarbejdning af fuld længde HTT samt alternativ splicing8,9 kan spille en vigtig rolle i patogenesen af HD. N-terminal HTT fragmenter kan udgøre en patologisk form af HTT, der kan samle hurtigt, samme, og fremskynde eller udbrede sammenlægning proces10.
Men tilstedeværelsen af disse optagelser, ikke nødvendigvis er korrelerer med HTT-fremkaldt toksicitet eller celle død11. HTT har foreslået at gennemgå en sammenlægning proces fra en opløselig monomer gennem opløselige oligomere arter og β-plade fibriller til uopløselige aggregater og indeslutninger12. Løse disse forskellige protein arter via standard biokemiske analyser har været en udfordring i feltet på grund af deres stabilitet i lav-vaskemiddel lysisbuffer og svært ved at visualisere ved hjælp af standard biokemiske assays. Således er metodiske overvejelser kritisk i påvisning af grad og mønster af akkumulerede og samlede mHTT.
Protokollen præsenteres her er en metode til at visualisere flere mellemprodukter af HTT, specielt dannelsen af en uopløselig HMW HTT arter, der vises til nøje styr med HD patogenese og sygdom progression1,13 ,14. At være i stand til at løse og spore flere arter af mHTT giver forskere et biokemisk værktøj at studere sygdom patogenese og vurdere potentielle terapeutiske interventioner gennem deres graduering og indvirkning på sygdommen patogenese.
Nogle forholdsregler er nødvendige for de ovenstående protokoller til at sikre konsekvent og kvantitative resultater. Første mHTT i begge fraktioner spontant vil danne aggregater over tid på flere fryse tø cykler, især når de er i en høj koncentration. Det er således afgørende at fryse delprøver af protein preps, og tø kun den nødvendige mængde, inden du kører analysen, som beskrevet i ovennævnte protokol. Yderligere, hvis uopløselige brøkdel udbytter hvid fældningsmiddel efter optøning, rekonstitutio…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH (RO1-NS090390). Vi vil også gerne takke Dr. Joan Steffanfor teknisk bistand og diskussion under udviklingen af denne analyse.
Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |