En metod som beskrivs för fraktionering av olösliga och lösliga muterade huntingtin arter från mus hjärnan och cell kultur. Den beskrivna metoden är användbar för karakterisering och kvantifiering av huntingtin protein flux och aids analysera protein homeostas i sjukdomspatogenes och i närvaro av störningar
Ansamling av felveckning proteiner är central för patologi i Huntingtons sjukdom (HD) och många andra neurodegenerativa sjukdomar. Särskilt viktiga patologiska HD kännetecknas av avvikande ansamling av muterade HTT (mHTT) protein i ultrahög molekylvikt komplex och intracellulära inkludering organ består av fragment och andra proteiner. Konventionella metoder att mäta och förstå bidragen från olika former av mHTT-innehållande aggregat inkluderar fluorescensmikroskopi, western blot analys och filter fälla analyser.
Men de flesta av dessa metoder är konformation specifika och kan därför inte lösa hela delstaten mHTT protein flux på grund av den komplicerade karaktären av aggregerade löslighet och upplösning.
För identifiering av aggregerad mHTT och olika modifierade former och komplex är separation och lösbarhet av cellulära aggregat och fragment obligatoriskt. Beskriver här vi en metod för att isolera och visualisera lösliga mHTT, monomerer, oligomerer, fragment och en olöslig hög molekylvikt (HMW) samlat mHTT arter. HMW mHTT spår med sjukdomsprogression, överensstämmer med musen beteende utläsningar och har varit fördelaktigt moduleras av vissa terapeutiska interventioner1. Denna strategi kan användas med musen hjärnan, perifera vävnader och cellkultur men kan anpassas till andra modellsystem eller sjukdom sammanhang.
Störningar av protein kvalitetskontroll nätverk som säkerställer korrekt vikning och nedbrytning av cellulära proteiner är sannolikt central till patologi i Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD), och andra ”protein felvikning” sjukdomar i2,3. En detaljerad förståelse av de proteostasis nätverkskomponenterna och deras bidrag till patologi är därför avgörande att utveckla förbättrade terapeutiska interventioner. HD orsakas av onormal utvidgning av en CAG upprepning inom HS-genen resulterar i en utökad sträcka av polyglutamines (polyQ) i proteinet huntingtin (HTT)4. Ett konsekvent patologiska inslag i HD patogenes är den resulterande Skellefteåsjukan, ackumulering och aggregering av HTT i regioner i hjärnan och i perifera vävnader, som har visat sig på flera sätt störa normal cell homeostas och funktion 5 , 6. medan HTT uttrycks ubiquitously, medellång taggig nervceller i striatum är selektivt sårbara och mest öppet påverkas med anmärkningsvärda kortikal atrofi även associerade med HD patogenes.
Bildandet av aggregat av HTT i hjärnan hos HS patienter och djurmodeller har vanligtvis serveras som proxy markör för sjukdomsprogression och dominant-negativ vinst på funktion för mHTT7. Även om de exakta mekanismer genom vilka protein Skellefteåsjukan och aggregation kan bidra till mHTT-inducerad toxicitet förblir oklart, är bildandet av dessa inneslutningar i hjärnan av HS-patienter och olika djurmodeller ett invariant och oundvikliga inslag. Inneslutningar visas att bestå till stor del av ackumulerade HTT fragment som innehåller N-terminalen utökades polyQ, vilket indikerar att proteolys och bearbetning av fullängds HTT samt alternativ splitsning8,9 kan spela en viktig roll i patogenesen av HD. N-terminala HTT fragment kan utgöra en patologisk form av HTT som kan aggregera snabbt, kärnbildas, och accelerera eller sprida den aggregation process10.
Men korrelerar förekomsten av dessa inneslutningar inte nödvändigtvis med HTT-inducerad toxicitet eller cell död11. HTT har föreslagits att genomgå en aggregering processen från en löslig monomer genom lösliga Oligomera arter och β-ark fibriller till olösliga aggregat och inneslutningar12. Att lösa dessa olika protein arter via standard biokemiska analyser har varit en utmaning i fältet på grund av deras stabilitet i låg-tvättmedel lyseringsbuffert och svårigheten att visualisera använder biokemisk standardanalyser. Metodologiska överväganden är således viktiga att upptäcka graden och mönster av ackumulerade och aggregerad mHTT.
Det protokoll som presenteras här ger en metod för att visualisera flera intermediärer av HTT, särskilt bildandet av en olöslig HMW HTT art som verkar nära spåra med HD patogenes och sjukdom progression1,13 ,14. Kunna lösa och spåra flera arter av mHTT ger forskare en biokemisk verktyg för att studera sjukdomspatogenes och utvärdera potentiella terapeutiska interventioner genom sin modulering och inverkan på sjukdomspatogenes.
Vissa försiktighetsåtgärder krävs för ovanstående protokoll att säkerställa konsekvent och kvantitativa resultat. Första mHTT i båda fraktioner spontant bildar aggregat över tid på flera frysa tö cykler, särskilt när du är i en hög koncentration. Det är således viktigt att frysa alikvoter av de protein-preps, och Tina endast den behövs volymen innan du kör analysen som beskrivs i protokollet ovan. Ytterligare, om olösliga bråkdel ger vita fällningsmedel vid upptining, beredning kan vara nödvändi…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av NIH (RO1-NS090390). Vi vill också tacka Dr Joan Steffanfor tekniskt bistånd och diskussion under utvecklingen av denna analys.
Sterile Filter | Millipore | SCGP505RE | Screw cap, sterile vaccum filter |
1 mL Tissue Grinder, Dounce | Wheaton | 357538 | |
Sonicator | Qsonica | Model Q125 | |
DC Protein Assay | Biorad | 5000111 | Comparable to Lowry assay |
Tris 1M buffer solution | Alfa Aesar | J60636 | |
Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
NaCl 5M solution | Teknova | S0251 | |
Glycerol | Fisher | BP229-1 | |
20% SDS solution | Teknova | S0295 | |
N-ethylmaleimide | Sigma | E1271 | |
Phenylmethylsulfony flouride | Sigma | P7626 | create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4°C |
Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | Create 0.5M stock solution in water |
Leupeptin | Sigma | L2884 | Create 10mg/ml stock solution in water |
Aprotinin | Sigma | A1153 | Create 10mg/ml stock solution in water |
Sodium Fluoride | Sigma | S4504 | Create 500mM stock solution in water |
Anti-HTT | Millipore | MAB5492 | Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay |
Anti-GAPDH | Novus Biologicals | NB100-56875 | Use 1:1000 for soluble western blot |