Apresentamos um protocolo para investigar os biomarcadores de expressão do mRNA de células periósteo-derivado (PDCs) induzidas pela vitamina C (vitamina C) e 1,25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH)2D3]. Além disso, avaliamos a capacidade dos PDCs para diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos.
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Artigo de método
Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células-tronco mesenquimais (MSCs) estão presentes em uma variedade de tecidos e pode ser diferenciadas em vários tipos de células, incluindo os osteoblastos. Entre as fontes dentais de MSCs, o periósteo é um tecido facilmente acessível, que foi identificado para conter MSCs na camada do cambium. No entanto, esta fonte ainda não foi amplamente estudada.
Vitamina D3 e 1,25-(OH)2D3 foram demonstradas para estimular a diferenciação em vitro de MSCs em osteoblastos. Além disso, vitamina C facilita o crescimento de células de formação e osso de colágeno. No entanto, nenhum estudo ainda investigou os efeitos da vitamina D3 e vitamina C no MSCs.
Aqui, apresentamos um método de isolar o MSCs do periósteo alveolar humano e examinar a hipótese de que 1,25-(OH)2D3 podem exercer um efeito osteoindutivo nessas células. Podemos também investigar a presença de MSCs no periósteo alveolar humano e avaliar a proliferação e a adesão de células-tronco. Para avaliar a capacidade da vitamina C (como um controle) e as diferentes concentrações de 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8e 10−7 M) para alterar a chave biomarcadores de mRNA em expressão de RNAm de MSCs isoladas de fosfatase alcalina (FAL ou ALP), osso sialoprotein (BSP), ligação núcleo fator alfa-1 (CBFA1), 1-colágeno e osteocalcina (OCN) são medidos usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR).
Introdução
Apesar de inúmeras técnicas relevantes têm sido desenvolvidas nos últimos anos, osso restos de reconstrução limitado por várias restrições e estimar que a extensão da reconstrução necessária muitas vezes é impossível. Aumento do tecido duro é necessário para alcançar objetivos estéticos e funcionais, além de uma taxa de sucesso a longo prazo favoráveis. Métodos comumente utilizados para tais procedimentos incluem enxerto ósseo autólogo e alogênico, Xeno e aloplásticos transplante de osso. Entre os vários tipos de enxerto ósseo, enxertos ósseos autógenos são considerados os mais eficazes. Entretanto, a morbidez do local doador, vascularização comprometida e tecido limi....
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Protocolo
O protocolo de estudo foi aprovado pelo institucional Review Board de Chang Gung Memorial Hospital. Todos os participantes fornecido o consentimento informado por escrito.
1. tecido preparação
- Colha os tecidos periosteal de pacientes durante a cirurgia dental (Figura 1). Após reflexão flap sob anestesia local, pegue um pedaço de tecido do periósteo do osso alveolar usando um separador periosteal31.
- Após a colheita, armazene as fatias periosteal tecidos de aproximadamente 5 × 2 mm na salina de tampão fosfato de Dulbecco (DPBS) com 300 U/mL de penicilina e 300 mg/mL de ....
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Resultados
Para todos os ensaios quantitativos, os dados são apresentados como média ± desvio-padrão (SD). Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o Student t-teste. No total, 34 amostras foram obtidas com uma idade média de participantes de 48,1 ± 12,3 y. onze destas amostras foram obtidas de pacientes do sexo masculino e 23 do sexo feminino. Vinte e oito amostras foram obtidas a partir das regiões molares e seis das regiões anteriores; 26 foram obtidos de maxila e 8 da mand.......
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Discussão
Uma modalidade terapêutica recentemente desenvolvida, ou seja tecido de engenharia que impliquem MSCs, tem inúmeras vantagens. MSCs, que estão presentes em diversos tipos de tecido, são células multipotentes que podem se diferenciar em uma variedade de células de tecidos mesodérmicos funcional37 e outras células, como os osteoblastos.
O periósteo serve como um nicho de células progenitoras, e como uma fonte de rica vascularização para o osso envolve-38.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
O protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional para clínicas pesquisa de Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 4728B-101 e 103-4223C). Este estudo foi suportado por Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 e NMRPG3C0151). Este manuscrito foi editado por Wallace edição académica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| ácido 2-fosfo-L-ascórbicosal trissódico | Sigma | 49752 | |
| Placas de cultura de 35 mm | Corning | 430165 | |
| 3-isobutil-1-metilxantina | Sigma | I5879 | |
| Placa de 6 poços | Corning | 3516 | |
| Fosfatase alcalina | ABI | Hs01029144_m1 Kit de | |
| ensaio colorimétrico de atividade de fosfatase alcalina | BioVision | K412-500 | |
| vírus da mieloblastose aviária transcriptase reversa | Roche | 10109118001 | |
| CD146 | BD | 561013 | |
| CD19 | BD | 560994 | |
| CD34 | BD | 560942 | |
| CD44 | BD | 561858 | |
| CD45 | BD | 561088 | |
| CD73 | BD | 561014 | |
| CD90 | BD | 561974 | |
| Cell banker1 | ZEAOAQ | 11888 | |
| fator de ligação ao núcleo alfa-1 | ABI | Hs00231692_m1 | |
| dexametasona | Sigma | D4902 | |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| GAPDH | ABI | Hs99999905_m1 | |
| HLA-DR | BD | ||
| indometacina | Sigma | I7378 | |
| insulina | sigma | 91077C | |
| insulina– transferência– selênio-A | Sigma | I1884 | |
| MicroAmp Placa de reação rápida de 96 poços (0,1 ml) | Vida | útil 4346907 | |
| filme adesivo óptico MicroAmp | Vida | útil 4311971 | |
| Mínimo Essential Medium 1X Alpha Modification | HyClone | SH30265.02 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Tampão de permeabilização | eBioscience | 00-8333-56 | |
| Piruvato de sódio | Gibco | 11360070 | |
| STRO-1 | BioLegend | 340103 | |
| SYBER Green PCR Master Mix | AppliedBiosystems | 4309155 | |
| TaqMan Master Mix | de 4304437 | ||
| -β | Sigma | T7039 | |
| Reagente Trizol (para isolamento de RNA) | Vida | 15596018 | |
| β-glicerofosfato | Sigma | G9422 | |
| colágeno-1 | Invitrogen | primer direto 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'OCN | |
| Invitrogen | primário para a frente 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'BSP | ||
| Invitrogen | primer para a frente 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'Primers | ||
| ALP comerciais Primers | |||
| CBFA1 comerciais |
Referências
- Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
- Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Or....
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Reimpressões e permissões
