We presenteren een protocol om te onderzoeken het mRNA uitdrukking biomarkers voor beenvlies-afgeleide cellen (PDC’s) geïnduceerd door vitamine C (vitamine C) en 1,25-dihydroxy vitamine D [1,25-(OH)2D3]. Daarnaast evalueren we het vermogen van PDC’s te differentiëren in osteocytes, chondrocyten en adipocytes.
Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn aanwezig in een aantal weefsels en kan worden onderscheiden in vele celtypes, met inbegrip van botcellen. Onder de dental bronnen van MSCs is het beenvlies een gemakkelijk toegankelijke weefsel, dat MSCs bevatten in het cambium laag is geconstateerd. Echter, deze bron is niet nog veel onderzocht.
Vitamine D3 en 1,25-(OH)2D3 hebben aangetoond dat het stimuleren van in vitro differentiatie van MSCs in botcellen. Daarnaast is vitamine C vergemakkelijkt collageen vorming en bot celgroei. Geen enkele studie heeft echter nog onderzocht de effecten van vitamine D3 en vitamine C op MSCs.
Hier presenteren we een methode voor het isoleren van MSCs van menselijke alveolaire beenvlies en onderzoeken van de hypothese dat 1,25-(OH)2D3 een osteo-inductief effect op deze cellen kunnen uitoefenen. Wij onderzoeken de aanwezigheid van MSCs in de menselijke alveolaire beenvlies en evalueren van de hechting van de cel van de stam en proliferatie. Ter beoordeling van het vermogen van vitamine C (als een besturingselement) en verschillende concentraties van 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−910−8en 10−7 M) te wijzigen van belangrijke mRNA biomarkers in geïsoleerde MSCs mRNA uitdrukking van alkalische fosfatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core bindende factor alpha-1 (CBFA1), collageen-1 en osteocalcin (OCN) worden gemeten met behulp van real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR).
Hoewel talrijke relevante technieken zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren, bone wederopbouw blijft beperkt door meerdere beperkingen, en het schatten van dat de omvang van de noodzakelijke wederopbouw is vaak niet onmogelijk. Harde-weefsel augmentatie is vereist om zowel esthetische als functionele doelen naast een gunstige succestarief voor lange termijn te bereiken. Methoden gebruikte voor dergelijke procedures omvatten Autogeen en allogene bottransplantaat, xenografting en alloplastic bottransplantaat. Onder de verschillende soorten bottransplantatie, autogene bottransplantaten worden beschouwd als de meest effectieve. Donor site morbiditeit, gecompromitteerde vasculariteit en beperkte weefsel beschikbaarheid1 zijn echter belangrijke nadelen voor Autogeen bottransplantaat geweest. Daarnaast zijn allogene bottransplantaten en xenografts geassocieerd met de overdracht van de ziekte. Op dit moment worden synthetische bottransplantaten veel gebruikt deze problemen op te lossen. Echter, met hun gebrek aan osteogenic mogelijkheden, klinische resultaten hebben sterk uiteen. Materialen zoals cellulose zijn en gekoppeld volume schommelingen, infectie, een gebrek aan kracht.
De vergroting van het bot met behulp van weefselengineering heeft veel belangstelling gegenereerd. Bij deze techniek, zijn mesenchymale stamcellen (MSCs) in eerste instantie gebruikt om osteoblast differentiatie, die vervolgens op de site van botverlies om bot reparatie worden getransplanteerd. Deze procedure wordt momenteel toegepast in celtherapie. Het bereiken van botreconstructie door het extraheren van een beperkte hoeveelheid weefsel is eenvoudiger en minder invasieve vergeleken met andere methoden.
De potentiële rol van MSCs als een hulpmiddel voor cel-gebaseerde therapieën gericht op tandheelkundige regeneratie is een opkomende belangstelling diverse onderzoeksgroepen. Studies hebben bevestigd dat MSCs kunnen worden onderscheiden van de volgende soorten weefsel: beenmerg, obesitas, synoviale membraan, pericyte, trabecular bot, menselijke navelstreng en tandheelkundige weefsels2,3. Gemeenschappelijke bronnen van MSCs omvatten het beenmerg, vetweefsel en tandheelkundige weefsels. Vergeleken met MSCs afgeleid van vetweefsel en het beenmerg, zijn de voordelen van tandheelkundige stamcellen gemakkelijke toegankelijkheid en minder morbiditeit na de oogst. Vergeleken met embryonale stamcellen, MSCs afgeleid van tandheelkundige weefsel nonimmunogenic verschijnen en niet zijn gekoppeld aan complexe ethische bezwaren3.
In 2006, de International Society for cellulaire therapie aanbevolen met behulp van de volgende normen te identificeren MSCs: ten eerste MSCs moet kunnen koppelen aan kunststof. Ten tweede, MSCs moet voor de oppervlakte antigenen, CD105, CD73 en CD90 positief en negatief voor de markeringen voor de B-cellen naast de hematopoietische antigenen CD45 en de CD344, monocyten en macrofagen. Als laatste criterium moet MSCs bekwaam om te onderscheiden in de volgende drie soorten cellen onder standaardvoorwaarden van in vitro differentiatie: botcellen, adipocytes en chondrocyten4. Tot op heden zijn zes soorten menselijke tandheelkundige stamcellen geïsoleerd en gekenmerkt. Het eerste type werd geïsoleerd uit menselijke pulp weefsel en postnatale tandmerg stamcellen5genoemd. Vervolgens drie aanvullende soorten tandheelkundige MSCs zijn geïsoleerd en gekenmerkt: stamcellen uit geëxpandeerd melkgebit6, de parodontale ligament7en de apicale Papil8. Meer recentelijk, tandheelkundige follikel afkomstige9, gingival weefsel afkomstige10en tandheelkundige bud stam cells(DBSCs)11periapical cyste MSCs (hPCy-MSCs)12 ook geconstateerd.
Nikolai was de eerste om te definiëren MSCs13. MSCs vertonen een potentiële hoge proliferatie en kunnen worden gemanipuleerd zodat u kunt onderscheiden voordat wordt getransplanteerd, die doen vermoeden dat zij ideale kandidaten voor regeneratieve procedures10 zijn.
Hoewel de meeste studies hebben het beenmerg gebruikt als een bron van stamcellen, beenvlies-afgeleide cellen (PDC’s) zijn ook onlangs14gebruikt. Het beenvlies is meer bereikbaar dan het beenmerg is. Daarom in deze techniek gebruiken we alveolaire beenvlies elimineren de noodzaak voor extra incisies tijdens de operatie en het verminderen van postoperatieve morbiditeit bij patiënten. Het beenvlies is het bindweefsel die de buitenste bekleding van lange beenderen vormt en bestaat uit twee afzonderlijke lagen: de buitenste vezelige laag bestaat uit fibroblasten, collageen en elastische vezels15en de innerlijke cel-rijke cambium laag in rechtstreeks contact met het oppervlak van bot. De cambium-laag bevat een gemengde celpopulatie, voornamelijk fibroblasten16, botcellen17, pericytes18en een kritische subpopulatie geïdentificeerd als MSCs19,20,21. De meeste studies hebben gemeld dat PDC’s vergelijkbaar zijn, zo niet superieur, aan het beenmerg-afgeleide cellen van de stam (bMSCs) in bone genezing en regeneratie22,23,24. Het beenvlies is gemakkelijk bereikbaar en uitstekende regeneratieve effectiviteit vertoont. Enkele studies hebben echter gericht op het beenvlies25,26,27.
Met betrekking tot bot reparatie houdt de huidige klinische praktijk de transplantatie van periosteal voorlopercellen versterkt binnen ondersteunende steigers. Recente studies hebben gericht op het verwerven van stamcellen gebreken regio en voorlopercellen voor weefsels regeneratie20in dienst. Tandartsen is ook anticiperen op toekomstige toepassing van parodontale bot regeneratie in parodontale behandelingen en implantaten. Met betrekking tot de donor-site, kan het beenvlies gemakkelijk worden geoogst door algemene tandheelkundige chirurgen. Dit steekt gunstig tegen beenmerg stromale cellen, zoals het beenvlies bereikbaar tijdens routinematige mondelinge chirurgie. Dus, het doel van deze studie is om een protocol voor het oogsten van PDC’s en om te beoordelen van de morfologie, bijlage, levensvatbaarheid en proliferatie van cellen van de stam van het menselijke beenvlies.
Vitamine D metabolieten van invloed zijn op de in vivo bot-mineraal dynamisch evenwicht. Één studie gemeld dat de 24R,25-(OH)-2D3 actieve vorm van vitamine D essentieel voor de osteoblastic differentiatie van menselijke MSCs (hMSCs)28 is. Bot homeostase en reparatie worden geregeld door een netwerk van vitamine D3 metabolieten, van welke 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) de meest biologisch actieve en betrokken bij de regulering van de gezondheid van het been is. Vitamine D3 is essentieel voor verkalking29. In een studie met behulp van 2-d-oude Kunming witte muizen, de embryoid lichamen in de muizen aangegeven dat vitamine C en vitamine D supplementen effectief bevorderd de differentiatie van ESC-afgeleide botcellen30. Onder zijn andere biologische activiteit stimuleert 1,25-(OH)2D3 de in vitro differentiatie van hMSCs naar botcellen, die kunnen worden gecontroleerd op basis van de toename in alkalisch fosfatase (ALP) enzymactiviteit of OCN gen expressie.
Enkele studies hebben ontdekt een dosis-respons relatie van gecombineerde behandelingen met vitamine C en 1,25-(OH)2D3 in menselijke PDC’s met een bijzondere focus op bot weefselengineering. Daarom in deze studie onderzoeken we de optimale concentratie voor afzonderlijke of gecombineerde behandeling van 1,25-(OH)2D3 en vitamine C voor inducerende osteogenic differentiatie van menselijke PDC’s. Het doel van dit protocol is te bepalen of een celpopulatie geïsoleerd van de tandheelkundige alveolaire beenvlies cellen met een MSC fenotype en of deze cellen kunnen worden in cultuur (in vitro) uitgebreid en gedifferentieerd bevat tot het gewenste weefsel . Daarnaast evalueren we het vermogen van PDC’s te differentiëren in osteocytes, chondrocyten en adipocytes. Het tweede deel van de studie evalueert de effecten van vitamine C en 10−10, 10−910−8en 10−7 M 1,25-(OH)2D3 op de osteogenic activiteit van PDC’s. Het primaire doel van deze studie is om te beoordelen van de functies van vitamine C en 1,25-(OH)2D3 tijdens de osteoblastic differentiatie van PDC’s door ALP activiteit, en pro-osteogenic genen, zoals ALP, collageen-1, OCN, BSP en CBFA1. Bovendien, bepaalt deze studie de osteo-inductief optimale voorwaarden voor menselijke PDC’s op basis van deze bevindingen.
Een onlangs ontwikkelde therapeutische modaliteit, namelijk weefsel engineering inhoudt MSCs, heeft tal van voordelen. MSCs, die in verschillende weefseltypes (HLA) aanwezig zijn, zijn Multipotente cellen die in een scala aan functionele mesodermal weefsel cellen37 onderscheiden kunnen en andere cellen zoals botcellen.
Het beenvlies fungeert als een niche voor voorlopercellen en als een rijke therapieën voorziening voor het bot omhult het38. In …
The authors have nothing to disclose.
Het studie-protocol werd goedgekeurd door de institutionele Review Board voor klinisch onderzoek van Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B en 103-4223C). Deze studie werd ondersteund door Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 en NMRPG3C0151). Dit manuscript werd uitgegeven door Wallace academische bewerken.
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt | Sigma | 49752 | |
35-mm culture dishes | Corning | 430165 | |
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
6 well plate | Corning | 3516 | |
Alkaline phosphatase | ABI | Hs01029144_m1 | |
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit | BioVision | K412-500 | |
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase | Roche | 10109118001 | |
CD146 | BD | 561013 | |
CD19 | BD | 560994 | |
CD34 | BD | 560942 | |
CD44 | BD | 561858 | |
CD45 | BD | 561088 | |
CD73 | BD | 561014 | |
CD90 | BD | 561974 | |
Cell banker1 | ZEAOAQ | 11888 | |
core binding factor alpha-1 | ABI | Hs00231692_m1 | |
dexamethasone | Sigma | D4902 | |
DPBS | Gibco | 14190250 | |
FBS | Gibco | 26140-079 | |
GAPDH | ABI | Hs99999905_m1 | |
HLA-DR | BD | 562008 | |
indomethacin | Sigma | I7378 | |
insulin | sigma | 91077C | |
insulin–transferrin–selenium-A | Sigma | I1884 | |
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) | Life | 4346907 | |
MicroAmp optical adhesive film | Life | 4311971 | |
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification | HyClone | SH30265.02 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333-56 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
STRO-1 | BioLegend | 340103 | |
SYBER Green PCR Master Mix | AppliedBiosystems | 4309155 | |
TaqMan Master Mix | Life | 4304437 | |
transforming growth factor-β | Sigma | T7039 | |
Trizol reagent (for RNA isolation) | Life | 15596018 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
collagen-1 | Invitrogen | forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 | |
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3' | |||
OCN | Invitrogen | forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' | |
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3' | |||
BSP | Invitrogen | forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' | |
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3' | |||
Commercial ALP primers | |||
Commercial CBFA1 primers |