Изоляция Брюшина производные тучных клеток и их функциональные характеристики с Ca2 +-изображений и дегрануляции анализов
Summary
Здесь мы представляем протокол к изоляции и культивировать мышиных перитонеальных тучных клеток. Мы также обсудим два протокола для их функциональных характеристик: флуоресцентных изображений внутриклеточных бесплатно Ca2 + концентрации и пробирного дегрануляции основе колориметрические количественная оценка выпущенной β-hexosaminidase.
Abstract
Тучные клетки (MCs), как часть иммунной системы, играют ключевую роль в защите принимающей страны против нескольких возбудителей и в инициировании аллергических иммунного ответа. Активация MCs через cross-linking поверхности IgE связана с высоким сродством IgE рецептором (FcεRI), а также путем стимулирования несколько других рецепторов, инициирует подъем уровня свободного внутриклеточных Ca2 + ([Ca2 +]я) что способствует высвобождение медиаторов воспалительных и аллергических. Идентификация молекулярных компонентов, участвующих в этих сигнальных путей имеет решающее значение для понимания регулирования MC функции. В этой статье мы опишем протокол для изоляции типа МКН, перитонеальный лаваж мышиных соединительной ткани и культивирование перитонеальный MCs (ЧВК). Культур MCs от различных моделей мыши нокаут по этой методике представляют собой полезный подход к идентификации белков, участвующих в MC, сигнальные пути. Кроме того мы также описать протокол для одной ячейки фура-2 изображений как важный метод количественного определения Ca2 + сигнализации в MCs. флуоресценции основе мониторинга [Ca2 +]я является надежным и обычно используется подход к Изучите Ca2 + сигнализации событий, включая вход работает магазин кальция, который имеет первостепенное значение для MC активации. Для анализа MC дегрануляции мы описываем пробирного релиз β-hexosaminidase. Количество β-hexosaminidase, выпустила в среду культуры считается дегрануляции маркера для всех три различных секреторных подмножества описанных в MCs β-hexosaminidase могут быть легко количественно по его реакции с colorigenic субстрата в микротитровальных пластины колориметрического анализа. Этот высоко воспроизводимый метод с точки зрения затрат и не требует специализированного оборудования. В целом, предоставленный протокол демонстрирует высокий урожай МКН, выражая типичный MC поверхностных маркеров, отображение типичных морфологических и Фенотипические особенности MCs и демонстрирует высокую воспроизводимость ответы на secretagogues в Ca2 +– изображений и дегрануляции анализов.
Introduction
МКН играть заметную роль во время врожденного и приобретенного иммунного ответа. В частности MCs участвовать в убийстве патогенов, таких как бактерии и паразиты и также ухудшить потенциально токсичных эндогенного пептидов или компоненты яды (для обзора см. Галли et al. 20081). Физиологическая роль МКН в врожденная и адаптивного иммунитета является предметом оживленных дискуссий. Таким образом многочисленные расхождения данных в исследованиях, выполненных с различными моделями мышь MC-недостаточным требует систематической переоценки иммунологической функции помимо специальные2МКН. Зрелые MCs преимущественно локализуются в ткани и органы, такие, как кожи, легких и кишечника и обычно находятся только в небольших количествах в крови. MCs являются производными от кроветворных прекурсоров, таких как MC прародителями и завершить их дифференцировки и созревания в микросреды почти все васкуляризированной тканей1. Т-клеток, полученных фактор интерлейкина (IL) -3 выборочно способствует жизнеспособности, пролиферации и дифференцирования плюрипотентных населения мыши MCs от их гемопоэтических прародителями3. Стволовых клеток фактора (SCF) производится структурных клеток в тканях и играет решающую роль в развитии MC, выживания, миграции и функции4. Свойства отдельных MCs может отличаться в зависимости от их способность синтезировать и хранить различные протеазы или протеогликанов. В мышей так называемой соединительной ткани тип MCs отличаются от слизистой MCs согласно анатомической локализации, морфология и содержание гепарина и протеаз5.
В MCs, увеличение свободной цитозольной Ca2 + ([Ca2 +]я) является необходимым для дегрануляция и производства эйкозаноидов, а также для синтеза цитокинов и активация факторов транскрипции в ответ на антиген и различные secretagogues6. Главная задача течению этих стимулов — фосфолипаза C, который гидролизует фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат диацилглицерол (DAG) и инозитол 1,4,5-trisphosphate. Даг активирует Протеинкиназа С и IP3 освобождает ионы Ca2 + от эндоплазматического ретикулума. Истощение этих магазинов активирует Ca2 + приток через плазматическую мембрану Ca2 + каналы, ведущие к хранить запись оперированных кальция (SOCE). Этот процесс вызвал путем взаимодействия Ca2 +-датчик, стромы взаимодействия молекулы-1 (Stim1), в эндоплазматический ретикулум с Orai17 , а также через активацию Переходный рецепторный потенциал канонические (Термизатор) канала белки (для обзора см. Freichel и др. 20148) в плазматической мембраны.
Для изучения физиологической роли этих каналов, несколько фармакологических (применение блокаторы кальциевых каналов) или генетические подходы обычно используются. В последнем случае, подавление экспрессии белка достигается путем ориентации мРНК (нокдаун) или геномной ДНК редактирования с глобальной или ткани конкретных9 исключить экзона кодирования поры, образуя Субблок канала (нокаут). Наличие окон с достаточной точностью для этих каналов является ограниченной. Кроме того, бросовым подход требует тщательного контроля ее эффективность с помощью, например., Западная пятно анализа и препятствует отсутствие специфических антител для целенаправленных канал протеина во многих случаях. Таким образом использование моделей мышей нокаут до сих пор рассматривается как золотой стандарт для такого анализа. Предпочтительным в vitro модель для исследования функций MC является выращивание ЧВК, которые могут быть изолированы ex vivo как полностью зрелые населения (в отличие от дифференциации МКН в vitro от, например., клетки костного мозга)10 . По сравнению с MCs костного производных (BMMCs), которые также часто используются для изучения MC функции в пробирке, стимуляция FcεRI и бета hexosaminidase релиз увеличивается спецавтотехнике и 100 раз в компании “ПМКС”, соответственно. В этой статье мы опишем способ изоляции и культивирование мышиных ЧВК, который позволяет получить после 2 недель культивирования большое количество чистого соединительной ткани типа МКН, достаточного для дальнейшего анализа.
Несмотря на недавний прогресс в разработке и применении показателей генетически закодированный кальция их использование по-прежнему ограничивается трудностями в доставке генов в клетки-мишени, конкретно, в весьма специализированных клеток, таких как основной культурный MCs. Кроме того эта группа Люминесцентные индикаторы для [Ca2 +]я измерений по-прежнему не хватает ratiometric красители с высоким динамическим диапазоном. По этим причинам предпочтительным методом для ratiometric [Ca2 +]я измерения по-прежнему является использование флуоресцентных красителей «Фура-2»11.
В настоящее время наиболее часто используемый подход для оценки MC активации и дегрануляции измерения β-hexosaminidase деятельности. Β-hexosaminidase, аллергических посредника, является одним из компонентов MC гранул, которые совместно выпущенные с гистамина в постоянной пропорции от MCs12. Β-hexosaminidase легко и точно измерять через его реакции с конкретного субстрата, который производит измеримые количество colorigenic продукт, который легко обнаружить в Гонав колориметрические assay. Сообщается, что в этой статье, применение этого метода для анализа ЧВК дегрануляции в ответ на различные стимулы.
Агрегирование высокоспецифичные рецепторы плазмалеммарного IgE (FcɛRI) активирует в MCs универсальный внутриклеточных сигнальный путь, приводит к высвобождению содержание секреторных гранул в окружающем пространстве внеклеточного. Помимо специфического антигена, многие другие раздражители могут активировать MCs выпустить разнообразных иммуномодулирующих посредников, таких как дополнение anaphylatoxins (например., C3a и С5а)13, эндотелина вазоконстриктора пептид 1 (ЭТ1)14 , а также многочисленные Катионный вещества и препараты, провоцируя pseudoallergic реакций (например., icatibant)15 путем привязки к MRGPRX216. Внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в MRGPR-индуцированной MCs дегрануляции характеризуются плохо по сравнению с FcɛRI опосредованной внутриклеточная сигнализация; Эти пути только начал интенсивно изучаться в течение последних нескольких лет17 после идентификации рецептор16. В основном каналы иона плазматической мембраны, участвующих в вход кальция, следуют MRGPRX2 стимуляции по-прежнему следует понимать. Таким образом настоящей статьи также фокусируется на сигнализацию внутриклеточного кальция и дегрануляции MCs стимулировали с агонисты MRGPR.
Protocol
Representative Results
Discussion
MC модели могут успешно использоваться для изучения MC дегрануляции, хемотаксис, сцепления, а также разъяснению внутриклеточных сигнальных путей участвует в активации MC. Некоторые исследователи, использование человека MCs модели, такие как увековечена линии (LAD2 и HMC1) или человека MCs произ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать Julia Geminn для оказания технической помощи в подготовке тучных клеток и культивирования. Эта работа была поддержана трансрегиональных совместный исследовательский центр (TR-SFB) 152.
Materials
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
Referências
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as “tunable” effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
