Tavşan manken dayanıklı Transgene ifade juguler ven ortak karotid arter interpozisyonu Greftler için
Summary
Bu yöntem interpozisyonu ven greft tavşanların yerleşimini, greft iletim ve dayanıklı transgene ifade ulaşılmasına anlatılmaktadır. Bu soruşturma transgenes ve protein ürünlerini aşılı damarlarında fizyolojik ve patolojik rolleri ve gen terapileri ven greft hastalığı için test sağlar.
Abstract
Ven greft bypass cerrahisi tıkayıcı damar hastalığı için ortak bir tedavidir; Ancak, uzun vadeli başarı greft hatası nedeniyle kan pıhtılaşması, intimal hiperplazi ve ateroskleroz ile sınırlıdır. Bu makalenin amacı iki taraflı venöz interpozisyonu Greftler giyen bir tavşan….. yerleştirerek, sonra Greftler dayanıklı transgene ifade elde bir gen transferi vektör ile transducing bir yöntem göstermektir. Yöntemi normal ven greft homeostazı, genler ve protein ürünleri biyolojik rollerinin incelenmesi sağlar. Ayrıca transgenes ven greft başarısızlık, e.gengelleyebilir faaliyetleri için test sağlar., ister bir transgene ifade neointimal büyüme engeller, damar iltihabı azaltır veya ateroskleroz tavşanların azaltır beslenen yüksek yağlı diyet ile. Bir ilk hayatta kalma ameliyat sırasında sağ ve sol dış juguler ven parçalarını çıkardım ve bilateral ters uç-yan ortak karotid arter interpozisyonu greft yerleştirilir. 28 gün sonra gerçekleştirilen ikinci bir hayatta kalma ameliyat sırasında her greft dolaşımı damar klipleri ile yalıtılmış ve lümen (bir arteriotomy) yardımcı bağlı adenoviral (HDAd) vektör içeren bir çözüm ile doldurulur. 20-min kuluçka sonra vektör çözüm emişli, arteriotomy tamir ve akış geri yüklenir. Damarları bireysel deneysel iletişim kuralları tarafından dikte zaman noktalarda hasat. Greft yerleştirme ve iletim arasında 28 günlük gecikmeye arteriyel dolaşımı için ven greft adaptasyon sağlamak gereklidir. Bu adaptasyon hızlı önce veya hemen sonra aşılama transduced ven greft oluşur transgene ifade kaybı önler. Sağlam, dayanıklı transgene ifade aşılı damarlarında elde etmek için onun yetenek benzersiz bir yöntemdir. Diğer büyük hayvan ven greft modellerle karşılaştırıldığında, tavşan düşük maliyetli ve kolay kullanım avantajları var. Kemirgen ven greft modellerle karşılaştırıldığında, tavşan bol doku analizi için sağlamak daha büyük ve daha kolay manipüle kan damarları var.
Introduction
Ateroskleroz lipid birikimi ve damar duvarındaki inflamasyon gemi lümen, kalp krizi, felç ve bacaklarda1,2kaybı daralma için kurşun Kronik iltihabi bir hastalıktır. Perkütan girişimler (Örn., anjiyoplasti ve stent uygulamaları) ve medikal tedavi (e.g., Statinler ve antiplatelet ajanlar) yararlı tedaviler için ateroskleroz; Ancak, koroner ve periferik dolaşımları ciddi obstrüktif hastalık her iki tedavisinde etkisiz çoğu zaman. Bypass greftleme, otojen damar parçalar, kullanarak şiddetli, diffüz koroner ve periferik damar hastalığı3,4olan hastalar tedavi için ortak bir yordam kalır. Ancak, her iki koroner yerleştirilen Greftler damar ve periferik dolaşımları zavallı uzun vadeli açıklık oranlarına sahip. Koroner dolaşım ven greft 1 yıl ve % 50 tıkandı yaklaşık % 10-20 10 yıl5,6tarafından tıkandı. Periferik dolaşım ven greft başarısızlık oranları 30-%50 5 yıl7de vardır.
Tam yerinde hastalığın bir tedavi gen ürünü teslim edebilirsiniz çünkü gen tedavisi damar grefti başarısızlık önlenmesi için çekici bir yaklaşımdır. Buna göre çok sayıda preklinik çalışmaları ven greft gen terapisi8,9test ettik. Ancak, aslında tüm bu çalışmaların erken zaman puan (2-12 hafta)10,11,12,13,14,15, etkinliğini inceledik 16 , 17. gen tedavisi müdahalelerin dayanıklı sağlayabilir bulgusuna farkındayız genellikle sonuçlar neointimal hiperplazi ve ateroskleroz4geç ven greft hatalarına karşı koruma (yıl). Aşılı damarlarında dayanıklı transgene ifade sağlar ve böylece gen tedavisi müdahalelerin geç gibi erken zaman noktalarda test sağlayan bir yöntem geliştirdik. Dayanıklı transgene ifade elde etmek için HDAd vektörler ve Gecikmeli İletim strateji yöntem içermektedir. HDAd vektörel çizimler sağlamak uzun süreli transgene ifade onlar viral genler tarafından bağışıklık sistemi18,19,transduced hücre tanıma (ve ret)20, önlenmesi, eksikliği nedeniyle 21. Ertelenen iletim (greft yerleştirme sonrası gerçekleştirilen 28 gün) erken aşılama22sonra oluşan arterialization işlemi sırasında transduced hücrelerinin kaybı önler.
Ven greft iletim greft yerleştirme10,11,12,15,16 zamanında tedavi transgene ifade ven greft duvardaki ulaşmak diğer yöntemleri itimat ,17. Seri olarak ölçülen zaman transgene ifade bu yaklaşım kullanarak hızlı bir şekilde iletim22,23sonra azalır. Buna göre bu yaklaşımı kullanarak çalışmalar ven, etkinlik 4 hafta ötesinde değerlendirilmesi ile en değil bir aşılama sonra 12 hafta ötesinde etkinliğini inceleyen değil. Buna ek olarak, bizim Yöntem damar grefti elde stably en az 24 hafta boyunca ve arterler büyük olasılıkla gerçekleştirilen benzer çalışmalar üzerinde tabanlı devam ederse transgene ifade devam ediyor uzun süre22,24. Biz kararlı transgene ifade, bu süre elde hiçbir diğer damar grefti gen terapisi müdahalesi farkındayız.
Bir tavşan modeli bizim yöntem geliştirmek için kullanılır. Diğerleri kemirgenler, tavşan, kullanmış ya da damar sınamak için daha büyük hayvanlar gen terapisi10,11,12,15,16,17,25grefti, 26. Kemirgen modellerle karşılaştırıldığında, adatavşanı are daha pahalı ve daha sıkı düzenleyici gereksinimlerine tabidir. Ancak, daha büyük hayvanlar için karşılaştırıldığında (Örn., domuzlar ve köpekler), adatavşanı are çok daha az pahalı satın almak ve ev ve işlemek daha kolay. Ayrıca, insan damarlarının fizyolojik tavşan damarları benzer27, onlar yeterince büyük perkütan girişimler28,29test etmek için kullanılabilir ve bu yeterli doku sağlar birden çok uç nokta (Örn., histoloji, protein, RNA) bir tek damar numune22,30kullanılarak incelenebilir. Ven greft tavşanlarla yüksek yağlı diyet ile beslenir, buna ek olarak, onlar ven greft ateroskleroz31,32, koroner arter bypass ven greft başarısızlık4,5 ortak bir neden olan geliştirmek . Bu aterosklerotik tavşan ven greft gen terapisi müdahaleler bu yöntemle teslim test etmek için bir substrat olarak hizmet verebilir. Sağlanan Protokolü tavşan ven greft dayanıklı transgene ifade ulaşmak için gerekli teknik becerileri Master müfettişler yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı kritik adımlarda anestezi yönetimi, arter/aşılı damar anticoagulation, cerrahi manipülasyon ve aşılı damarın hemodinamik ölçümleri içerir. İki nispeten uzun işlemleri (genellikle 3-3.5 bilateral ven greft için h ve ikili greft iletim için 1,5-2,5 h) içeren bu modelde birden çok hayatta kalma cerrahi anestezi düzgün yönetimi önemlidir. Biz anestezi ile bir nosecone ve endotrakeal entübasyon tarafından yönetilen ve entübasyon pozitif basınç havalandırma atelectasis engell…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
Referências
- Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
- Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. Lancet. 382, 1329-1340 (2013).
- Mohr, F. W., et al. Coronary artery bypass graft surgery versus percutaneous coronary intervention in patients with three-vessel disease and left main coronary disease: 5-year follow-up of the randomised, clinical SYNTAX trial. Lancet. 381, 629-638 (2013).
- de Vries, M. R., Simons, K. H., Jukema, J. W., Braun, J., Quax, P. H. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes. Nat Rev Cardiol. 13 (8), 451-470 (2016).
- Harskamp, R. E., Lopes, R. D., Baisden, C. E., de Winter, R. J., Alexander, J. H. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions. Ann Surg. 257, 824-833 (2013).
- Sabik, J. F. Understanding saphenous vein graft patency. Circulation. 124 (3), 273-275 (2011).
- Owens, C. D., Ho, K. J., Conte, M. S. Lower extremity vein graft failure: a translational approach. Vasc Med. 13, 63-74 (2008).
- Robertson, K. E., McDonald, R. A., Oldroyd, K. G., Nicklin, S. A., Baker, A. H. Prevention of coronary in-stent restenosis and vein graft failure: does vascular gene therapy have a role. Pharmacol Ther. 136, 23-34 (2012).
- Yla-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular Gene Therapy: Past, Present, and Future. Mol Ther. 25, 1095-1106 (2017).
- Schwartz, L. B., et al. Adenoviral-mediated gene transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts. J Vasc Surg. (5), 874-881 (1999).
- Eefting, D., et al. Local lentiviral short hairpin RNA silencing of CCR2 inhibits vein graft thickening in hypercholesterolemic apolipoprotein E3-Leiden mice. J Vasc Surg. 50, 152-160 (2009).
- Handa, M., et al. Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft. J Vasc Surg. 48 (6), 1566-1574 (2008).
- Kloppenburg, G. T., Grauls, G. E., Bruggeman, C. A., Stassen, F. R. Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in a rat model. Interact Cardiov Th. 8, 31-34 (2009).
- Eefting, D., et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 88, 367-375 (2010).
- Eichstaedt, H. C., et al. Gene transfer of COX-1 improves lumen size and blood flow in carotid bypass grafts. J Surg Res. 161, 162-167 (2010).
- Kritz, A. B., et al. In vivo modulation of Nogo-B attenuates neointima formation. Mol Ther. 16 (11), 1798-1804 (2008).
- Peroulis, M., et al. The role of ex-vivo gene therapy of vein grafts with Egr-1 decoy in the suppression of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc. 40, 216-223 (2010).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and b-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5731-5736 (1996).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. P Natl Acad Sci USA. 93, 13565-13570 (1996).
- Chen, H. -. H., et al. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. P Natl Acad Sci USA. 94, 1645-1650 (1997).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Du, L., Zhang, J., Clowes, A. W., Dichek, D. A. Efficient gene transfer and durable transgene expression in grafted rabbit veins. Hum Gene Ther. 26, 47-58 (2015).
- Channon, K. M., et al. Efficient adenoviral gene transfer to early venous bypass grafts: comparison with native vessels. Cardiovasc Res. 35, 505-513 (1997).
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- George, S. J., et al. Sustained Reduction of Vein Graft Neointima Formation by Ex Vivo TIMP-3 Gene Therapy. Circulation. 124, 135-142 (2011).
- Chiu-Pinheiro, C. K., et al. Gene transfer to coronary artery bypass conduits. Ann Thorac Surg. 74, 1161-1166 (2002).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Ribichini, F., et al. Effects of oral prednisone after stenting in a rabbit model of established atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 50, 176-185 (2007).
- Langheinrich, A. C., et al. Quantification of in-stent restenosis parameters in rabbits by Micro-CT. Rofo. 177 (4), 501-506 (2005).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 37, 316-327 (2017).
- Zwolak, R. M., Kirkman, T. R., Clowes, A. W. Atherosclerosis in rabbit vein grafts. Arteriosclerosis. 9, 374-379 (1989).
- Qiang, B., et al. Statin therapy prevents expansive remodeling in venous bypass grafts. Atherosclerosis. 223, 106-113 (2012).
- Casa, L. D. C., Ku, D. N. Thrombus Formation at High Shear Rates. Annu Rev Biomed Eng. 19, 415-433 (2017).
- Chen, C., Coyle, K. A., Hughes, J. D., Lumsden, A. B., Ku, D. N. Reduced blood flow accelerates intimal hyperplasia in endarterectomized canine arteries. Cardiovasc Surg. 5 (2), 161-168 (1997).
- Binns, R. L., Ku, D. N., Stewart, M. T., Ansley, J. P., Coyle, K. A. Optimal graft diameter: effect of wall shear stress on vascular healing. J Vasc Surg. 10, 326-337 (1989).
- Oka, K., Mullins, C. E., Kushwaha, R. S., Leen, A. M., Chan, L. Gene therapy for rhesus monkeys heterozygous for LDL receptor deficiency by balloon catheter hepatic delivery of helper-dependent adenoviral vector. Gene Ther. 22, 87-95 (2015).
- Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
- Chorny, M., et al. Site-specific gene delivery to stented arteries using magnetically guided zinc oleate-based nanoparticles loaded with adenoviral vectors. FASEB J. 27, 2198-2206 (2013).
- Hoshino, K., et al. Three catheter-based strategies for cardiac delivery of therapeutic gelatin microspheres. Gene Ther. 13, 1320-1327 (2006).
- Nouri, F., Sadeghpour, H., Heidari, R., Dehshahri, A. Preparation, characterization, and transfection efficiency of low molecular weight polyethylenimine-based nanoparticles for delivery of the plasmid encoding CD200 gene. Int J Nanomed. , 5557-5569 (2017).
- Jia, S. F., et al. Eradication of osteosarcoma lung metastases following intranasal interleukin-12 gene therapy using a nonviral polyethylenimine vector. Cancer Gene Ther. , 260-266 (2002).
- Morishita, R., et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest. 93, 1458-1464 (1994).
