新生児マウス脳の線条体細胞の遺伝的操作の定位手術
Summary
新生児マウス脳の線条体にマイクロインジェクション試薬は自家製頭固定デバイスに定位手術のプロトコルについて述べる。この手法では、新生児マウス脳の特定の領域の神経細胞で遺伝子操作ことができます。
Abstract
多くの遺伝子は萌芽期の脳で表されます、それらのいくつかは継続的に出生後、脳で表現されます。このような永続的に表現された遺伝子の彼らは、発達過程や新生児の脳の生理機能を調節する機能があります。脳の特定の遺伝子の神経生理機能を調べるためには、脳における遺伝子を不活化する不可欠です。ここでは、新生児のタイム ・ ウィンドウでトランスジェニック マウス線条体における遺伝子発現の不活化する簡便な脳定位固定装置について述べる。Microinjected AAV eGFP Cre ウイルスはあった生後日 (P) 定位脳手術による 2 Ai14 レポーター遺伝子マウスの線条体に。P14 線条体、成功の Cre loxP AAV 導入線条体細胞での DNA 組換えを介した示唆 tdTomato レポーター遺伝子発現が検出されました。さらに、P2Foxp2フロリダ州/フロリダマウスに AAV eGFP Cre ウイルス マイクロインジェクションによるこの技術を検証しました。GFP と Foxp2 の二重ラベル GFP 陽性細胞に導入 AAV eGFP Cre 線条体における Foxp2 蛋白質の損失を示唆、P9 の線条体の Foxp2 を免疫反応性が欠けていたことを示した。一緒に取られて、これらの結果は、floxed トランスジェニック マウスの新生児の脳の特定の神経細胞集団におけるてんかん microinjected AAV eGFP Cre ウイルスによって効果的な遺伝子欠失を示します。結論としては、私たちの脳定位固定装置の手法は、新生児マウス脳における遺伝子操作の簡単でシンプルなプラットフォームを提供します。テクニックだけが使えないことが新生児の脳の特定の領域に遺伝子を削除するが、それはまた、薬の薬理学的、神経トレーサー、遺伝子組み換えの研究と chemogenetics タンパク質、神経活動の指標を注入する使用ことができ、新生児マウス脳の線条体に他の試薬。
Introduction
構造の近代的な研究と脳の機能が神経細胞の特定の遺伝子の遺伝的操作を通常要求します。完全、トランスジェニック マウスを含む突然変異体の対立遺伝子を運ぶの異なる遺伝子の機能を調べるため、ノックアウト、ノックイン対立遺伝子を定期的に生成されます。大人の齧歯動物の脳定位固定脳外科手術は、ローカル齧歯動物の頭脳1,2の特定の領域に薬物、ウイルス、トレーサーおよびその他の試薬を提供する標準的な方法です。トランスジェニック マウスに定位脳手術を適用することにより、遺伝子遺伝子機能およびマウス脳の特定の神経集団の神経活動を操作する 1 つ。セル型固有の操作は、脳の3,4、5の複雑な神経回路の神経機能を解読する強力なアプローチを提供します。
神経系の神経系の発達が初期胚の段階から始まり、幼齢期まで生後後発達プロセス続行します。神経系の成熟生後には6脳の生理学的および認知機能のために不可欠である正確なシナプス神経回路網の配線が含まれます。したがって、新生児のタイム ・ ウィンドウで発生する発達のイベントの勉強は通常の神経系の発達を理解するためだけではなく重要ですが、また神経発達や精神疾患7 の病因に洞察力を提供することがあります。 ,8。大人の齧歯動物の脳定位固定脳外科手術の方法がすぐに利用できる2,9, いくつかのプロトコルが新生児マウス10,11脳定位固定脳外科手術のためのインターネットで利用できます。実際には、マウスの新生仔ラットの脳に試薬の脳定位固定装置の薬剤は困難、新生児子犬の頭は非常に傷つきやすい標準脳定位固定装置で固定されるためです。それにもかかわらず、トランスジェニック マウスへの定位脳手術の適用は新生児マウス12可能です。ここでは、マウスの新生仔ラットの脳定位固定脳外科手術を実行する自家製セットアップと簡単な方法をについて説明します。このテクニックにより、レポーター遺伝子マウスおよび条件付きで floxed トランスジェニック マウスの線条体に Cre DNA の AAV 表現の recombinase マイクロインジェクションによる floxed 遺伝子を条件付きで削除する 1 つを示します。この方法は、野生型マウスの新生児の線条体に試薬を提供するも。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では新生児マウス脳の線条体に AAV ウィルスを注入するシンプルで信頼性の高い定位法を紹介します。我々 は P2 で Ai14 レポーター マウスの線条体に AAV eGFP Cre ウイルスを microinjected し、P14、レポーター遺伝子の発現を分析します。AAV 導入 GFP 陽性細胞は rostrocaudal レベルで線条体全体がわかった。さらに、ほぼすべての GFP 陽性細胞は共同 AAV による Cre 活性の発現によって誘導される?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は科学省によって支えられた、パワーオプティマイザーの技術は MOST104-2311-B-010-010-MY3、MOST106-2321-B-010-012、国家衛生研究院を与える NHRI-EX106-10429NI と注目領域研究センター プログラム助成脳研究センター、台湾国立陽明大学を通して教育省・員 MOST106-2811-B-010-031 (s ・ エンライテンメント)、MOST105-2811-B-010-036 MOST106-2811-B-010-030 (H. 社長交代)。
Materials
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1K |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506×1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1×1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
Referências
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