Стереотаксической хирургии для генетических манипуляций в полосатой клеток мозга новорожденных мыши
Summary
Мы описываем протокол стереотаксической хирургии с домашним головы Исправлена устройством для microinjecting реагенты в стриатума мозги новорожденных мыши. Эта техника позволяет генетические манипуляции в нейрональных клеток конкретных областей мозга новорожденных мыши.
Abstract
Многие гены выражены в эмбриональных мозги, и некоторые из них постоянно выражаются в мозге после рождения. Для такой настойчиво выраженное генов они могут функционировать для регулирования процесса развития и/или физиологических функций в мозге новорожденных. Расследовать нейробиологических функций конкретных генов в головном мозге, важно для инактивации генов в головном мозге. Здесь мы описания простой стереотаксического метода для инактивации экспрессии генов в стриатума трансгенных мышей на новорожденных времени windows. AAV-eGFP-Cre вирусы были microinjected в Полосатое тело Ai14 репортер генов мышей на послеродовой день (P) 2 по стереотаксической хирургии. Экспрессия генов tdTomato репортер был обнаружен в стриатума P14, предполагая, что успешный Cre-loxP при посредничестве рекомбинации ДНК в клетках AAV-преобразованы полосатой. Мы далее подтвержден этот метод microinjecting AAV-eGFP-Cre вирусов в P2Foxp2fl/fl мышей. Двойной маркировки GFP и Foxp2 показал, что GFP-положительных клеток не хватало Foxp2 иммунореактивности в P9 стриатума, предлагая потери Foxp2 белка в клетках полосатой AAV-eGFP-Cre преобразованы. Взятые вместе, эти результаты демонстрируют эффективных генетических удаления stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre вирусами в конкретных нейрональных популяций в мозге новорожденных floxed трансгенных мышей. В заключение наша стереотаксического техника обеспечивает легкий и простой платформу для генетических манипуляций в мозге новорожденных мыши. Этот метод может использоваться не только для удаления генов в конкретных регионах неонатальная мозги, но он также может использоваться для вставки фармакологических препаратов, нейронов трассировщиков, генетически модифицированных Оптогенетика и chemogenetics белки, показатели активности нейронов и другие реагенты в стриатума мозги новорожденных мыши.
Introduction
Современные исследования структуры и функции мозга обычно требуют генетические манипуляции специфических генов в нейрональных клеток. Зонда функции различных генов, трансгенных мышей, перевозящих мутантные аллели, включая регулярно созданы Выбивное и забивные аллелей. Стереотаксической хирургии для взрослых грызунов является стандартным методом для локально доставки наркотиков, вирусы, Трейсеры и другие реагенты для конкретных регионов грызунов мозги1,2. Применяя стереотаксической хирургии трансгенных мышей позволяет генетически манипулировать функции гена и активности нейронов в конкретных нейрональных популяций головного мозга мыши. Манипуляция определенного типа клеток обеспечивает мощный подход к расшифровать нейрональных функций в сложных нейронных цепей мозга3,4,5.
Нейронные развития нервной системы начинается на ранних эмбриональных стадиях, и процессов развития продолжать после рождения до периода несовершеннолетних. Послеродовой период созревания нервной системы включает в себя точные синаптической проводки нейронных цепей, которая необходима для физиологических и когнитивных функций мозга6. Таким образом изучение развития события, возникающие в windows неонатальной время важное значение не только для понимания нейронных нормального развития, но она также может обеспечить понимание патогенеза психомоторного развития и нервно-психических расстройств7 ,8. Хотя методы стереотаксической хирургии для взрослых грызунов легко доступны2,9, несколько протоколов доступны в Интернете для стереотаксической хирургии новорожденных мышей10,11. В самом деле стереотаксического микроинъекций реагентов в мозги новорожденных мыши щенков трудны, потому что глава новорожденным щенком слишком хрупкой, чтобы быть исправлена в стандартной стереотаксического аппарата. Тем не менее применение стереотаксической хирургии трансгенных мышей возможно для новорожденных мышей12. Здесь мы опишем простой метод с домашним установки для выполнения стереотаксической хирургии в мыши новорожденных щенков. Мы показываем, что этот метод позволяет условно удалять floxed гены, microinjecting рекомбиназа AAV-выражая Cre ДНК в стриатума репортер генов мышей и условно floxed трансгенных мышей. Этот метод применяется также для доставки реагентов в неонатальной стриатума мышей дикого типа.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем исследовании мы демонстрируем простой и надежный стереотаксического метода для инъекций AAV вирусов в стриатума мозги новорожденных мыши. Мы microinjected AAV-eGFP-Cre вирусов в Полосатое тело Ai14 репортер мышей на P2 и затем проанализировать выражение гена репортера на P14. Мы нашли, что AA…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Министерством науки и технологии предоставляет MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, национальных научно-исследовательских институтов здравоохранения грант НПУ-EX106-10429NI и Рекомендуемые области исследований центра программы грантов от Министерство образования через мозг научно-исследовательский центр, Национальный университет Yang Ming в Тайване, и докторантура стипендий предоставляет MOST106-2811-B-010-031 (S.-клуба), MOST105-2811-B-010-036 и MOST106-2811-B-010-030 (H.-ю.к.).
Materials
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1K |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506×1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1×1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
Referências
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
- Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
- Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
- Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
- Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
- Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
- Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
